Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài µg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian [20].
(∆A – b) x k x V a x 106
- 17 -
Hình 2.3. Phản ứng định lượng protein
Thực hành
- Pha dung dịch thuốc thử CBB.
- Thêm 2,5ml thuốc thử CBB vào 0,5ml mẫu, để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Đo độ hấp thu màu ở bước sóng 595nm.
- Dựng đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (OD) theo nồng đô albumin chuẩn (µg/ml).
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm dựng đồ thị chuẩn albumin
Ống nghiệm số 1 2 3 4 5 6
Dung dịch albumin 0,01% (ml) 0 1 2 3 4 5
Nước cất (ml) 10 9 8 7 6 5
Nồng độ protein (µg/ml) 0 10 20 30 40 50
Hút 0,5ml dung dịch albumin vừa pha loãng ở trên
Thuốc nhuộm CBB (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5
Tính tốn
Từ đường chuẩn y = a’x + b’ ở trên, suy ra hàm lượng protein cần phần tích bằng cơng thức sau:
Hàm lượng protein = (g) (∆A’ – b’) x k’ x V’
- 18 -
Trong đó:
- ∆OD’: giá trị OD của dung dịch protein mẫu cần xác định đã trừ với ống thử không.
- a’, b’: giá trị trong đường chuẩn protein (y = a’x + b’) - k’: số lần pha lỗng
- V’: thể tích ban đầu của mẫu (ml)