3.1.2. Kết quả tách phân đoạn polysaccharide bằng sắc ký lọc gel
Sau đó, các EPS và IPS thô được phân tách thành các phân đoạn khác nhau bằng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-200. Kết quả cho thấy cả EPS và IPS đều chứa 2 phân đoạn. Kết quả ở hình 3.1 cho thấy các phân đoạn polysaccharide đều là phức hợp của polysaccharide và protein. Tuy nhiên, tỷ lệ polysaccharide và protein của các phân đoạn có sự khác biệt lớn.
Để xác định hàm lượng polysaccharide và protein trong mẫu phân tích, ta cần dựa vào đường chuẩn tương ứng của chúng. Kết quả xây dựng đường chuẩn polysaccharide được thể hiện trong hình 3.1 dựa trên bảng 3.2 và đường chuẩn albumin được thể hiện trong hình 3.2 dựa trên bảng 3.3.
Sinh khối Chiết nhiều lần với nước cất
(mỗi lần chiết với điều kiện là 700C trong 3h)
Tủa cồn với tỷ lệ 1:4 (ủ 24h ở 40C)
Dịch ni cấy sau cơ quay
(giảm 1/5 thể tích so với dịch ni cấy ban đầu)
Cô quay ở nhiệt độ 600C
Dịch sau tủa Lọc qua giấy lọc
Đông khô, trữ ở 40C
Dịch chiết nước
- 26 -
Bảng 3.2 Kết quả đường chuẩn polysaccharide Nồng độ saccharose 0,1% (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 OD490 0,071 0,164 0,248 0,340 0,416 0,513 0,601 0,675 ∆OD490 0 0,093 0,177 0,296 0,345 0,442 0,530 0,604
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD490 và nồng độ saccharose chuẩn
Nhận xét:
Sử dụng đường chuẩn polysaccharide với phương trình y = 0,008x + 0,004 làm đường chuẩn để xác định hàm lượng polysaccharide trong mẫu phân tích.
Bảng 3.3. Kết quả đường chuẩn albumin Nồng độ albumin 0,01% (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 OD595 0,067 0,079 0,088 0,100 0,110 0,119 ∆OD595 0 0,012 0,021 0,033 0,043 0,052 y = 0,008x + 0,004 R² = 0,999 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0 20 40 60 80 Giá t rị OD 490n m Nồng độ saccharose chuẩn (µg/ml) Series1 Linear (Series1) Giá trị OD Đường chuẩn
- 27 -
Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa giá trị OD595 và nồng độ albumin chuẩn
Nhận xét:
Sử dụng đường chuẩn albumin với phương trình y = 0,001x làm đường chuẩn để xác định hàm lượng protein trong mẫu phân tích.
Phân đoạn IPS-1 và IPS-2 chứa nhiều protein, trong khi phân đoạn EPS-1 và EPS-2 chứa rất ít protein. Ở các phân đoạn IPS, IPS-1 có hàm lượng polysaccharide cao hơn và hàm lượng protein thấp hơn IPS-2. Ở các phân đoạn EPS, EPS-1 có hàm lượng polysacharide rất cao và chứa rất ít protein, trong khi phân đoạn EPS-2 chứa hàm lượng polysaccharide và protein đều rất thấp. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa và gây độc tế bào của các phân đoạn cũng khác nhau rõ rệt, chứng tỏ thành phần và cấu trúc của polysaccharide và protein có liên quan đến hoạt tính sinh học. Theo nghiên cứu của Kuo và cộng sự (2009), cao chiết cồn của Cordyceps sinensis
sau khi được tách phân đoạn qua cột silicagel, cho kết quả là 15 phân đoạn [29]. Điều này là hiển nhiên, vì cao chiết cồn chứa nhiều hợp chất, trong khi đó, cao chiết polysaccharide chỉ chứa các hợp chất polysaccharide.
y = 0,001xR² = 0,997 R² = 0,997 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0 10 20 30 40 50 60 Giá trị OD 595nm Nồng độ albumin chuẩn (µg/ml) Series1 Linear (Series1) Giá trị OD Đường chuẩn
- 28 -
Hình 3.3. Phân đoạn polysaccharide: (a) Phân đoạn IPS; (b) Phân đoạn EPS
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ tách phân đoạn và chưa xác định thành phần monosaccharide của các polysaccharide. Tuy nhiên, theo Zhong và cộng sự (2009) tổng hợp, một vài nghiên cứu cho thấy polysaccharide tách chiết từ
Cordyceps sinensis chủ yếu chứa glucose, mannose, galactose [23]. Các nghiên cứu
cũng chứng minh các polysacccharide có liên kết với protein tạo thành phức hợp có hoạt tính sinh học.