Dịch polysaccharide sau khi được tách chiết, sau đó được tủa với cồn 96% trong 24 giờ ở 40C để thu polysaccharide thô. Kết quả tủa với cồn 96% được trình bày trong bảng 3.1. Qua khảo sát, nhận thấy kết quả tủa tốt nhất khi tủa với tỷ lệ 1:4 (1 thể tích dịch ni cấy và 4 thể tích cồn). Do đó, trong các thí nghiệm sau để thu polysaccharide thơ, nhóm nghiên cứu chọn tỷ lệ tủa 1:4. Theo Zhong và cộng sự (2009) tổng hợp, Wang và cộng sự đã chứng minh hàm lượng polysaccharide trong sợi nấm Cordyceps sinensis là 153,7 mg/g; như vậy, kết quả này cao hơn kết quả của nhóm nghiên cứu chúng tôi [23]. Cũng theo Zhong và cộng sự (2009) tổng hợp, nghiên cứu của Xiao và cộng sự cho thấy tỷ lệ polysaccharide trong sợi nấm
Cordyceps gunnii là 13,9 %, thấp hơn Cordyceps sinensis [23]. Như vậy, hàm lượng
polysaccharide phụ thuộc vào chủng Cordyceps và tùy thuộc điều kiện nuôi cấy. Bảng 3.1. Khối lượng polysaccharide từ 100 ml dịch nuôi cấy được tủa (g)
Tỷ lệ dịch : cồn 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7
Khối lượng tủa lần 1 (g) 0,08 0,11 0,14 0,10 0,10 0,10
Khối lượng tủa lần 2 (g) 0,07 0,11 0,13 0,10 0,09 0,12
Khối lượng tủa lần 3 (g) 0,08 0,12 0,11 0,10 0,10 0,10
Khối lượng tủa trung
bình (g) 0,077 0,113 0,127 0,10 0,097 0,107 Hiệu suất (%) 7,7±0, 6 11,3±0, 6 12,7±1,5 3 10,0±0,17E- 17 9,7±0, 6 10,7±1,1 5 Theo thuyết minh đề tài, nhóm tác giả đề nghị khảo sát thời gian tủa polysaccharide. Tuy nhiên, qua khảo sát thực tế cũng như qua một số tài liệu khoa học, nhóm nhận thấy hầu hết tài liệu khoa học chứng minh tủa polysaccharide ở 24h trong điều kiện 40C là tối ưu. Mặt khác, khi khảo sát thời gian tủa ở 24h - 36h - 48h thì khơng nhận thấy có sự khác biệt về khối lượng polysaccharide thu được. Do đó, nhóm chọn thời gian tủa polysaccharide tối ưu là 24h. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với một số nghiên cứu trước đó. Theo Xiao và cộng sự (2003) , dịch nuôi cấy nấm Cordyceps được thu nhận và ly tâm 8500 vòng/phút trong 20 phút. Dịch nổi sẽ
- 23 -
được cơ đặc cịn 1/3 tổng thể tích ban đầu. Sau đó, bổ sung cồn 96% với tỷ lệ 1:2, giữ ở 40C, trong 1 giờ và ly tâm 8500 vòng/phút trong 20 phút. Tủa sẽ loại bỏ và dịch nổi được lọc qua màng lọc (Milipore 0,45µm). Dịch sau khi lọc sẽ tủa với cồn 96% theo tỷ lệ 1:4, lắc mạnh. Dung dịch tủa EPS được giữ 40C trong 24 giờ và tủa sẽ được thu nhận bằng cách ly tâm 8500 vòng/phút trong 20 phút, gạn bỏ dịch. Tủa EPS được đông khô chân không và tiến hành xác định khối lượng tủa [24]. Theo Kim và Yun (2005), dịch nuôi cấy nấm Cordyceps sẽ được thu nhận, ly tâm 9000
vòng/phút trong 20 phút và dịch nổi sẽ lọc qua giấy lọc Whatman 2. Dịch lọc cho tủa với cồn 96% theo tỷ lệ 1:4, lắc mạnh và giữ qua đêm ở 40C. Tủa được thu nhận bằng cách ly tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút và dịch được gạn bỏ. Tủa EPS được đông khô và tiến hành xác định khối lượng của EPS [11]. Theo Angelis (2009), dịch nuôi cấy nấm được thu nhận theo các thời điểm khác nhau, sau đó lọc trong chân khơng bằng giấy lọc Whatman 1. Dịch lọc sẽ được cơ nước xuống cịn ¼ thể tích ban đầu bằng máy cơ quay ở nhiệt độ dưới 500C. Dịch sau khi cô được thẩm tách qua màng thẩm tách 12 – 14 kDa, và tủa với cồn 960 theo tỷ lệ 1:4, lắc mạnh và để qua đêm ở 40C. Tủa EPS được thu nhận bằng cách ly tâm 10 000 vòng/phút trong 10 phút, gạn bỏ dịch nổi. Tiến hành đông khô mẫu EPS thu được và tiến hành xác định khối lượng của EPS [25]. Theo Lee và cộng sự (2009), dịch nuôi cấy nấm
Cordyceps được lấy ở những thời điểm khác nhau, tiến hành ly tâm 12000
vòng/phút trong 20 phút. Thu dịch nổi và tủa với ethanol tuyệt đối theo tỷ lệ 1:4, lắc mạnh và giữ qua đêm ở 40C. Tủa EPS được thu nhận bằng cách ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút, gạn bỏ dịch nổi. Tủa EPS được đông khô và tiến hành xác định khối lượng của EPS [26]. Theo Nehad và cộng sự (2010), sinh khối nấm được tách ra từ dịch môi trường lỏng bằng cách ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút và dịch nổi cho lọc qua giấy lọc Whatman 1. Dịch sau khi lọc được tủa với cồn 96% theo tỷ lệ 1:5 (v/v), giữ lạnh ở 40C qua đêm. Tủa EPS sẽ được thu nhận bằng cách ly tâm như trên. Hàm lượng EPS được xác định bằng phương pháp phenol–acid sulfuric hấp thu ở bước sóng 490 nm, lấy glucose làm chuẩn [27].
Từ kết quả tách chiết polysacharide từ dịch ni cấy, ta có quy trình tách chiết polysacharide là tủa với cồn ở tỷ lệ 1:4 trong 24h ở 40C. Áp dụng vào tách chiết
- 24 -
polysacharide thơ từ sinh khối, nhóm nhận thấy khơng có sự khác biệt về quy trình nên áp dụng quy trình này cho tách chiết polysaccharide thơ từ sinh khối. Kết quả thu nhận từ quy trình cho thấy hiệu suất thu polysaccharide thô từ dịch nuôi cấy là 12,7 % và từ sinh khối là 1,27 g. Như vậy, hiệu suất thu polysaccharide từ sinh khối
Cordyceps sinensis của đề tài này tăng 54,49 % so với kết quả là 6,92 % của tác giả
Hồ Thị Phương Thắm (2015) [28], cao hơn so với kết quả đăng ký trong thuyết minh đề tài. Đồng thời, quy trình thực hiện có khả năng thu 1,27 g polysaccharide từ dịch nuôi cấy), cao hơn so với kết quả đăng ký trong thuyết minh đề tài. Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu chúng tơi đưa ra quy trình tách chiết polysaccharide từ dịch nuôi cấy và sinh khối như sau: