Thử nghiệm độc tính SRB (Sulforhodamin B assay) (Nguyễn Thái Hoàng Tâm và cộng sự, 2007) [22]
Sử dụng có biến đổi quy trình do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI) công bố (In Vitro Cancer Cell Line Screen – Manual of Operations (08/2005)). Thử nghiệm SRB là một phương pháp so màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất. SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein. Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào. Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB. Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng. Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào. Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất nghiên cứu.
Quy trình như sau:
- Các dòng tế bào ung thư (từ thế hệ 4 đến 20) được nuôi trong mơi trường E’MEM có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) ở 370C và 5% CO2 đạt độ phủ khoảng 70-80%.
- Tách tế bào bằng trypsin/EDTA, loại môi trường; rửa lớp đơn tế bào bằng 2ml PBS (NaCl 10 g, KCl 0,25 g, Na2HPO4 1,44 g, KH2PO4 0,25 g, nước cất đủ 1l); loại PBS và thêm 1ml trypsin/EDTA vào bình cho ngập lớp đơn tế bào trong 1-2 phút; loại trypsin/EDTA và thêm 1ml mơi trường vào bình; nhẹ nhàng huyền
- 20 -
phù tế bào bằng pipette và chuyển 1ml dịch huyền phù tế bào vào eppendorf 1,5ml.
- Đếm tế bào bằng buồng đếm hồng cầu với phương pháp Trypan blue. Xác định tổng số tế bào trong 1ml.
- Tạo dịch tế bào đồng nhất có mật độ mong muốn bằng cách trộn dịch huyền phù tế bào ban đầu với mơi trường theo tính tốn ở trên.
- Đưa 100μl dịch tế bào đồng nhất vào mỗi giếng. Dán nhãn đĩa (giờ, ngày, người thực hiện, dòng tế bào). Kiểm tra đĩa dưới kính hiển vi để xem mức độ trải đều của dịch tế bào trong giếng. Đặt đĩa vào tủ ấm ủ trong 24 giờ.
- Pha lỗng polysaccharide bằng nước cất trong tủ vơ trùng. - Xử lý tế bào với mẫu polysaccharide: Ủ trong tủ ấm 48 giờ
- Cố định tế bào: lấy đĩa khỏi tủ ấm và thêm 50 μl TCA (trichloroacetic acid) 50% lạnh vào mỗi giếng; đặt đĩa trong tủ lạnh từ 1-3 giờ; lấy đĩa khỏi tủ lạnh và loại dịch trong các giếng bằng cách lật ngược đĩa; rửa đĩa 5 lần bằng nước (200μl/giếng), thấm đĩa trên giấy sau khi rửa. Đặt đĩa trên khay, để khơ ở nhiệt độ phịng trong 12-24 giờ.
- Nhuộm protein nội bào với SRB: thêm 100μl SRB vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 20 phút; rửa đĩa 4 lần với acid acetic 1% (200μl/giếng); thấm đĩa trên giấy sau khi rửa để loại acid acetic cịn lại; đặt đĩa trên khay, để khơ 12-24 giờ.
- Đọc kết quả: thêm 200 μl Tris 10 mM vào mỗi giếng; lắc đĩa trên máy lắc đến khi SRB cố định được hòa tan hết (10 phút); ghi nhận giá trị OD tại bước sóng 492 và 620 nm bằng máy đọc ELISA reader.
- Tính tốn tỉ lệ ức chế tăng trưởng tế bào theo công thức: I(%) = (1- (A(492-620)TN / A(492-620)C)) x 100% Trong đó:
I (%): phần trăm ức chế
A(492-620)TN: Giá trị OD của mẫu thí nghiệm
- 21 -
- Đối chứng dương được sử dụng trong phương pháp này là camptothecin. Đối với tế bào HepG2, camptothecin ở nồng độ 0,07 ppm có khả năng ức chế 50-60% sự phát triển của tế bào HepG2 thì quy trình được xem là ổn định.
- 22 -