CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.2. Nuôi cấy và bảo quản nấm men
Môi trường nuôi cấy nấm men:
Môi trường thường sử dụng để nuôi cấy nấm men là môi trường Hansen. Thành
phần môi trường bao gồm: Glucose: 50 g/l; Peptone: 10 g/l; KH2PO4: 3 g/l; MgSO4.7H2O: 3 g/l; Agar: 20 g/l.
Nuôi cấy và bảo quản giống nấm men:
Chuẩn bị môi trường Hansen có chứa agar, được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1atm trong 25 phút. Tiến hành cấy giống nấm men từ ống giống gốc lưu giữ ở tủ lạnh 40C tại phịng thí nghiệm sang ống mơi trường thạch nghiêng đã được chuẩn bị sẵn. Giống nấm men sau khi được nuôi cấy sang môi trường thạch nghiêng được đặt vào tủ
ấm và giữ ở 300C, trong 48 giờ, giống đã phát triển tốt được bảo quản trong tủ lạnh 40C [105].
Nhân giống:
Nhân giống cấp 1: Giống nấm men từ môi trường thạch nghiêng được cấy vào ống nghiệm chứa 5 ml dịch môi trường Hansen dịch thể đã khử trùng, nuôi cấy ở 28-300C trong 24 giờ.
Nhân giống cấp 2: Chuẩn bị bình tam giác dung tích 250 ml có chữa sẵn 100 ml dịch mơi trường Hansen đã hấp khử trùng, để nguội. Sau đó cho tồn bộ nấm men trong
ống nghiệm đã ni giống (nhân giống cấp 1) vào bình tam giác, tiến hành nuôi ở 300C, trong tủ lắc với tốc độ 200 vòng/phút và kết thúc sau 24 giờ [105].
Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu và được thực hiện như sau: Đặt lá kính lên khu vực buồng đếm, lắc đều dịch tế bào nấm men và dùng pipet lấy một
giọt cho vào khe ở mép buồng đếm, tránh tạo bọt khí. Dịch huyền phù sẽ đi vào buồng
đếm nhờ cơ chế mao dẫn. Sử dụng kính hiển vi với vật kính x40, tìm mạng ơ đếm ở khu
vực buồng đếm và đếm số tế bào trong 5 ô vuông lớn đại diện cho 25 ô vuông lớn trong ô trung tâm [105].
Cách tính: Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu được tính bằng cơng thức:
N = ( x
. ) x 103 x 10n
Trong đó:
N: Số lượng tế bào trong 1 ml mẫu nghiên cứu a: Số tế bào trong 5 ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn
400: Tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm 0,1: Thể tích dịch tế bào chứa trong ô trung tâm 103: Số chuyển mm3 thành ml
10n: Độ pha loãng mẫu