STT Tên chủng
Hoạt tính feruloyl esterase trên đĩa thạch (đường kính vịng phân giải - mm)(*) Hoạt độ enzyme acetyl esterase (U/L)(*) Nấm đảm (Basidiomycota) 1 Trametes consors G1 5,5 6,5 2 Trametes gibbosa SH3 10,8 0 3 Ganoderma applanatum CP800 3,2 7,4 4 Coprinus disseminates SH7 10,5 0 5 Tyromyces lacteus CP1 11,2 11,5 6 Trametes insularis CP2 10,8 15,3 7 Trametes palisoti CP3 9,6 7,3 8 Ganoderma oroflavum CP4 11,4 14,8 9 Ganoderma austral CP5 0 0 10 Coriolus unicolor SH1 0 4,6 11 Polystictus didrichsenii CP6 7,0 9,2 12 Campanella junghuhnii SH2 0 19,4 13 Coprinus disseminates SH7 10,3 0 14 Inonotus substygius SH9 0 0 15 Auricularia delicate SH18 2,1 6,3 16 Trametes gibbosa SH3 12,2 14,6 17 Marasmius maximus SH10 0 0 18 Ganoderma komingshegii SH11 0 21,4 19 Ganoderma sp. CP224 12,3 0
20 Hygrophoropsis aurantiaca SH19 0 4,7 21 Mycena galericulata. CP227 0 0 22 Nigroporus aratus CP552 0 19,2 23 Hexagonia apiaria CP702 0 0 24 Ganoderma applanatum CP800 3,6 0 25 Trametes consors G1 5,4 5,9 26 Poria versipora HL02 0 7,5 27 Phellinus sp. CP668 0 2,3 28 Bionectria sp. CP587 17,6 25,3 Nấm túi (Ascomycota) 29 Hypoxylon monticulosum CP629 16,1 34,2 30 Cladosporium spories SH01 14,6 19,8 31 Aureobasidium pullulans SH1 18,3 82,6 32 Hypoxylons deustrum SH01 4,3 4,8
33 Xylaria polymorpha A32 10,6 62,1
34 Xylaria polymorpha A34 5,7 50,3
35 Xylaria polymorpha A35 23,0 103,8
36 Morchela elata A30 4,3 2,5
37 Xylaria hypoxylon A38 6,5 9,4
38 Rosellinia sp. 5 7,3
39 Bisporella citrine A5 0 0
40 Nodulisporium sp. 0 6,3
41 Xylaria longipes A3 15 22,7
42 Daldinia concentrica A20 0 0
43 Daldinia vernicosa A31 0 5,6
*
Hoạt tính sinh tổng hợp feruloyl esterase được xác định thơng qua đường kính vòng phân giải cơ chất ethyl ferulate của các chủng sau 3-5 ngày phát triển trên đĩa thạch. * Hoạt tính acetyl esterase được xác định bằng phương pháp quang phổ (λ=405 nm;
α405= 2.5 mM-1 cm-1) qua khả năng thủy phân p-nitrophenyl acetate thành sản phẩm p- nitrophenol. Kết quả biểu thị là giá trị trung bình của 3 thí nghiệm lặp lại.
Hình 3.1. Hoạt tính feruloyl esterase của chủng nấm phân lập Alt. tenuissima SP66
Kết quả sàng lọc hoạt tính cho thấy, enzyme FAE phổ biến ở nhiều loài nấm, đặc biệt là nấm túi Ascomycota. Theo kết quả ở bảng 3.1, tỉ lệ nấm có hoạt tính feruloyl esterase thuộc Ascomycota (12/16 loài, tương đương ~75%) cao hơn đáng kể so với các chủng thuộc Basidiomycota (16/28 chủng, tương đương ~57%). Đường kính vịng phân
giải lớn nhất trên cơ chất ester được xác định được đối với các chủng thuộc ngành
Ascomycota là Alt. tenuissima SP66 (D = 25,0 mm). Hai chủng thuộc Basidiomycota có
khả năng sinh enzyme cao nhất là Bionectria sp. CP587 và Ganoderma sp. CP224 (D =
17,6 mm và 12,3 mm tương ứng).
Do biểu hiện hoạt tính sinh tổng hợp feruloyl esterase cao của nấm Alt. tenuissima SP66 nên chủng nấm trên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các
điều kiện nuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH.
Kết quả trong bảng 3.1 cho thấy, 32/44 chủng nấm biểu hiện hoạt tính sinh tổng hợp AE, trong đó có 14/16 chủng thuộc ngành Ascomycota và 19/28 chủng thuộc Basidiomycota. Hoạt tính từ 2,3 U/lđến 103,8 U/l đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate.
năng với hoạt tính AE 62,5 U/l. Trong khi đó hoạt tính cao nhất là chủng nấm túi X. polymorpha A35 với hoạt tính AE đạt tới 103,8 U/l. Ngoài ra, các chủng sinh tổng hợp
AE mạnh là X. polymorpha A32 (62,1 U/l); Aureobasidium pullulans SH1 (82,6 U/l) và
X. Polymorpha A34 (40,3 U/l). Hoạt tính tương đối cao được thấy ở chủng nấm thuộc nấm đảm là Bionectria sp. CP587 (25,3 U/l). Nhìn chung, xét theo tỉ lệ những chủng nấm phân lập, sàng lọc hoạt tính AE trong nghiên cứu này thì số chủng biểu hiện hoạt tính AE có sự khác biệt đáng kể giữa các loài nấm nghiên cứu thuộc ngành nấm túi Ascomycota (87% nấm có hoạt tính AE) và ngành nấm đảm Basidiomycota (67%). Tuy nhiên, hoạt độ enzyme này ở các loài nấm túi cao hơn rất nhiều so với loài nấm đảm [hoạt độ cao nhất 103,8 U/l (loài X. polymorpha A35) so với 25,3 U/l (Bionectria sp. CP587).
Như vậy, khi so sánh kết quả đánh giá hoạt tính sinh carbohydrate esterases (feruloyl esterase và acetyl esterase) có thể nhận thấy sự khác biệt về khả năng sinh tổng hợp hai enzyme thủy phân này giữa hai ngành nấm nghiên cứu. Theo đó, các lồi thuộc nấm túi Ascomycota cho thấy có khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterases cao hơn
đáng kể so với các loài thuộc nấm đảm Basidiomycota về cả tỷ lệ số lồi có hoạt tính và mức độ hoạt tính enzyme. Đáng chú ý, 3 loài (Alt.tenuissima SP66, X.polymorpha A35,
A.pullulans SH1) biểu hiện hoạt tính carbohydrate esterases cao là đều thuộc ngành nấm
túi Ascomycota. Một số chủng nấm biểu hiện hoạt tính sinh feruloyl esterase tương đối
tốt, như chủng nấm Coprinus disseminates SH7, Ganoderma sp. CP224 nhưng khơng
biểu hiện hoạt tính sinh acetyl esterase (Bảng 3.1). Đặc biệt trong nghiên cứu này, các loài nấm thuộc ngành Ascomycota cho thấy có khả năng sinh tổng hợp carbohydrate
esterases cao hơn nhiều so với các loài thuộc ngành Basidiomycota dựa trên cả tỷ lệ số
lồi có hoạt tính và mức độ hoạt tính enzyme (hoạt tính feruloyl esterase qua vòng phân giải cơ chất cao nhất là 25 mm đối với chủng Alt. tenuissima SP66 so với 17,6 mm đối
với chủng Bionectria sp. CP587. Tương tự, hoạt tính acetyl esterase của chủng X. polymorpha A35 là 103,8 U/l trong khi của chủng Bionectria sp. CP587 là 25,3 U/l).
Đối với chủng A.pullulans SH1 mặc dù hoạt tính AE cao nhưng quá trình tinh sạch tiếp theo cho thấy độ tinh sạch chưa đạt yêu cầu (kết quả không thể hiện ở đây). Do
vậy, chủng X.polymorpha A35 và Alt.tenuissima SP66 được lựa chọn cho các nghiên
cứu tiếp theo về khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase tương ứng.
Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối
lignocellulose sẽ được thực hiện.
3.3. Định danh các chủng phân lập hoạt tính cao
Song song định danh bằng phương pháp hình thái, hai chủng nấm tuyển chọn có hoạt tính cao là Alt.tenuissima SP66 và X.polymorpha A35 được định tên bằng phương
pháp sinh học phân tử.
3.3.1. Định danh chủng SP66
Kết quả điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 0,9% cho thấy ADN không bị gãy và sạch (D260/OD280 trong khoảng 1,8 đến 2,0). Cặp mồi ITS1/ITS4 đã nhân bản thành
công với ở nhiệt độ gắn mồi là 550C. Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 550 bp. Chất
lượng của sản phẩm PCR được thể hiện khi điện di trên gel agarose 0,9% chỉ có một
băng duy nhất, sáng đậm, đủ tiêu chuẩn cho tách đoạn gen nhân để giải mã trình tự (Hình
3.2).
Hình 3.2. (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% và (B) Sản phẩm PCR
của hai chủng nấm (SP66 và A35)
Phân tích với cặp mồi ITS1/ITS4 điện di trên gel agarose 1,5%. (M: marker phân tử 1 kb)
Kết quả giải trình tự gen nhân (ITS) với chủng nấm SP66:
Kết quả xác định trình tự vùng gen nhân (ITS) cho ảnh điện di đồ với các đỉnh
huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng. Sau khi loại bỏ trình tự mồi đã thu được trình tự nucleotide của chủng nấm ký hiệu SP66 có độ dài là 572 nucleotide:
SP66 A35 M SP66 A35
> SP66 GCGGGCTGGACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTG TCTTTTGGGGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAA CATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAATAATTACAAC TTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG CGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTA CCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGACT CGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAAGT CGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCAATTAAGCCTTTTTTTCAACTT TTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAG CGGAGGA
Trình tự nucleotide thu được của mẫu nấm SP66 được kiểm tra tính tương đồng (similarity) với các trình tự sẵn có trên ngân hàng Genbank bằng cơng cụ BLAST. Kết quả tìm kiếm cho thấy trình tự mẫu nấm SP66 tương đồng cao 99% với một số loài trong chi Alternaria (Alternaria tenuissima JX523613, Alternaria compacta FR846405, Alternaria tomatophila HE803347,..) thuộc họ Pleosporaceae. Khi so sánh trình tự mẫu
nấm SP66 với các loài trong chi khác thuộc họ Pleosporaceae thì mức độ tương đồng khá thấp (90%) đối với một số loài trong chi Bipolaris (Bipolaris sacchari AB179836,
Bipolaris tetramera KF753950); Stemphylium (Stemphylium vesicarium JQ988103,
Stemphylium solani JF913269); Curvularia (Curvularia lunata KC462186, Curvularia australiensis AY923860). Việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên Genbank nhằm mục đích
cho một kết quả tham chiếu với nhóm lồi tương đồng nhất với trình tự truy vấn.
Mơ hình tiến hóa tối ưu theo tiêu chuẩn AICc được xác định cho khối dữ liệu phân tích là TrN+G. các thơng số cơ bản là -lnL = 2820.6282, AIC = 5653.2563, K = 6, freqA = 0.2305, freqC = 0.2438, freqG = 0.2318, freqT = 0.2938, R(a) [A-C] = 1.0000, R(b)[A-G] = 1.5207, R(c) [A-T] = 1.0000, R(d) [C-G] = 1.0000, R(e) [C-T] = 2.5482, R(f) [G-T] = 1.0000, gamma Shape = 0.2442 được sử dụng để xây dựng cây phát sinh chủng loài.
Dựa trên kết quả của BLAST và phương pháp dựng cây phát sinh chủng loài để xác định tên khoa học cho chủng nấm SP66 (Hình 3.3).
Hình 3.3. Mối quan hệ họ hàng của chủng SP66 với các loài/dưới loài trong cùng chi
Song song với đó chủng nấm SP66 cũng được chụp hình thái bào từ trên kính hiển vi. Kết quả thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Chủng Alt. tenuissima [ký hiệu SP66; (A)] phát triển trên môi trường thạch và
hình thái bào tử [độ phóng đại x100; (B)]
Như vậy, từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích hình thái bào tử (Hình 3.4) có thể kết luận mẫu nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae.
3.3.2. Định danh chủng A35
Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sử dụng làm ADN khuôn cho phản ứng
PCR đọc trình tự. Quá trình xác định trình tự được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học
trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Phản ứng
đọc trình tự được thực hiện theo hai chiều bằng phương pháp giải trình tự trực tiếp.
Kết quả xác định trình tự vùng gen nhân (ITS-rADN) cho ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ ràng (kết quả không chỉ ra ở đây). Sau khi
loại bỏ trình tự mồi thu được trình tự nucleotide của chủng nấm A35 có độ dài là 600 nucleotide. > A35 GAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCA TTAAAGAGTTTTATAACTCCCAAACCCATGTGAACATACCGTACGTTGCCTCG GCAGGCTGCATCTCCCTGTGAGGTCCTACCCTGTAGGATGTTACGCTGTAAGG CTTAGCGGGAAGATGCATTAAAGCCTGCCGGCGGCCCATTAAACTCTGTTTA TTTTTGAATTCTGAGGCTATAATAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCT CTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAA TTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCACTAGT A B
ATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCCTGTTG CTTAGTGTTGGGAGCCTACGGTCAGCGTAGCTCCTCAAATGTAGTGGCGGAG TTGGTTCACACTCTAGACGTAGTAATTTTTATCTCGCCTGTGAGTTGGACCGG TCCCTCGCCGTAAAACCCCCAAAAATTTTAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTA GGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT
Trình tự thu được từ chủng nấm A35 được kiểm tra tính tương đồng (similarity)
với các trình tự sẵn có trên ngân hàng Genbank bằng cơng cụ BLAST. Kết quả tìm kiếm cho thấy trình tự mẫu nấm A35 tương đồng cao 99% với loài trong Xylaria polymorpha
FN689809). Tuy nhiên khi so sánh trình tự mẫu nấm A35 với các lồi trong chi Xylaria
thì mức độ tương đồng khá thấp: Xylaria schweinitzii JX256828 (96%); Xylaria scruposa KP133498 (92%); Xylaria grammica JQ341087 (90%); Xylaria laevis GU324746 (89%). Việc so sánh với cơ sở dữ liệu trên Genbank nhằm mục đích cho một kết quả tham chiếu với nhóm lồi tương đồng nhất với trình tự truy vấn. Dựa trên kết quả BLAST khơng thể kết luận chính xác về lồi. Với những trường hợp BLAST có độ bao phủ và tương đồng cao (99%) cũng không thể suy ngược lại tên lồi bởi kết quả BLAST chỉ hiển thị trình tự
Hình 3.5. Mối quan hệ họ hàng của chủng A35 với các loài/thứ trong cùng chi
Dựa trên kết quả của BLAST và sử dụng phương pháp dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.5) đã xác định được tên khoa học cho chủng nấm A35 là Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae.
3.4. Nghiên cứu sinh tổng hợp esterase
3.4.1. Nghiên cứu sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35
Thời gian lên men thích hợp trên môi trường rắn:
Để thu được lượng dịch lên men có hoạt tính cao đủ lớn cho các nghiên cứu tiếp,
chủng X. polymorpha A35 được nghiên cứu lên men rắn với quy mô 2-3 kg/mẻ ở 230C. Vật liệu sử dụng là sinh khối lignocellulose (rơm) dùng làm cơ chất lên men rắn thu enzyme AE.
Kết quả thể hiện trên hình 3.6 cho thấy sinh tổng hợp enzyme bắt đầu ngay sau ngày thứ 5 với hoạt tính AE tương ứng là 88±7 mU/g (đơn vị hoạt tính trên mỗi gram cơ chất). Hoạt tính enzyme cao nhất (1039±12 mU/g) thu được sau 10 ngày nuôi cấy nấm. Ở thời gian nuôi cấy tiếp theo hoạt tính enzyme giảm đáng kể (giảm 20-40% so với hoạt tính cao nhất). Như vậy, để thu được enzyme với hoạt tính cao quá trình lên men có thể kết thúc trong khoảng 10 ngày đến 2 tuần ni cấy. pH mơi trường có sự thay đổi không
đáng kể từ pH trung tính ban đầu đến axit yếu (pH 6,2) sau 25 ngày nuôi cấy. Kết quả
nghiên cứu động học này cho khởi đầu sinh tổng hợp AE và FAE bởi nấm X. polymorpha A35 xảy ra đồng thời nhưng thời điểm cho hoạt tính cao nhất rất khác nhau. Theo đó, nấm X. polymorpha A35 biểu hiện hoạt tính AE trước (ngay sau 10 ngày nuôi cấy) so với FAE (sau 25 ngày).
Hình 3.6. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35
trên mơi trường rắn
(●) Hoạt tính XpoAE (mU/g); (---): pH mơi trường. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần thể hiện độ lệch chuẩn (┴).
Thời gian lên men thích hợp trên mơi trường lỏng:
Chủng X. polymorpha A35 do biểu hiện hoạt tính acetyl esterase trên môi trường lên men rắn nên cũng được lựa chọn để xác định khả năng lên men trên môi trường lỏng
để khảo sát các điều kiện khác như: thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nhiệt độ và pH
nhằm xác định điều kiện tối thích cho sự phát triển cũng như khả năng sinh enzyme của chủng nấm túi này.
Nguồn carbohydrate có ảnh hưởng rất khác nhau đến sự sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase bởi nấm thuộc ngành Ascomycota trong mơi trường ni cấy lỏng. Vì vậy, hoạt tính của acetyl esterase trên các nguồn cơ chất khác nhau đã được theo dõi và so sánh, từ đó tìm ra nguồn cơ chất thích hợp nhất để tổng hợp enzyme.
Chủng X. polymorpha A35 được nuôi cấy ở điều kiện lắc 200 v/ph trong 28 ngày
ở 23-25oC trong môi trường lên men dịch thể bổ sung các cơ chất khác nhau. Cụ thể, hai nguồn cơ chất rơm và cà chua được sử dụng trong quá trình lên men.
Sau mỗi 3 ngày, dịch enzyme được thu để xác định hoạt tính acetyl esterase qua khả năng thủy phân p-nitrophenyl acetate.
Hình 3.7. Sự phát triển của nấm X. polymorpha A35 trên môi trường lỏng ở ngày thứ 10
Hình ảnh lên men chủng X. polymorpha A35 ở hình 3.7 cho thấy khả năng sinh
tổng hợp acetyl esterase mạnh trên môi trường bổ sung các cơ chất như cà chua (CC) và
rơm (R). Hoạt tính enzyme trong thời gian ni cấy (25 ngày) cao nhất lên đến 109,8 U/l (trên môi trường cơ chất là rơm) tại ngày nuôi thứ 10 sau đó hoạt tính giảm dần theo thời
gian, tại ngày ni cấy thứ 25 hoạt tính enzyme cịn 37,9 U/l. Nguồn cacbon khác nhau
ảnh hưởng lớn đến hoạt tính acetyl esterase của chủng X. polymorpha A35 theo đó hoạt
tính acetyl esterase cao nhất trên cơ chất cà chua là 75,9 U/l tại ngày nuôi thứ 5 sau đó giảm dần và ổn định trong các ngày nuôi cấy tiếp theo với hoạt tính dao động trong
khoảng 60 U/l. Giá trị pH môi trường với mỗi cơ chất dao động khác nhau với cơ chất là
rơm với pH dao động từ pH 6 đến pH 7.5, môi trường với cơ chất là cà chua pH dao động
từ pH 5,5 đến pH 7. Kết quả này thấy rằng, chủng X. polymorpha A35 thích hợp với nguồn cơ chất rơm sau 10 ngày nuôi cấy cho hoạt tính acetyl esterase cao nhất (109,8 U/l).
Hình 3.8. Động học sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X. polymorpha A35 trên các
mơi trường có bổ sung cơ chất
Cà chua (CC) và Rơm (R). pH: Cà chua: - -, Rơm: - ▪ -; Acetyl esterase: Cà chua - -, Rơm -●-
Acetyl esterase là enzyme thủy phân xúc tác giải phóng nhóm acetyl từ các
polysaccharit acetyl hóa như pectin hay xylan. Enzyme này từ một số nấm túi (ascomycetes) khác đã được miêu tả như Trichoderma reesei [126], A. niger [127], và Fusarium oxysporum [59]. Ngoài ra, enzyme này từ một số loài nấm đảm
(basidiomycetes) cũng đã được nghiên cứu [128] công bố khả năng sinh acetyl esterase từ nấm mục gỗ Coriolus versicolor trên mơi trường có cơ chất mùn gỗ. Thời gian lên men
để sinh tổng hợp acetyl esterase của chủng này lâu hơn nhiều so với chủng Cladosporium
spories SH01 và chủng X. polymorpha A35 (sinh enzyme mạnh sau 9 và 10 ngày nuôi cấy so với 6 tuần ở chủng C. versicolor). Theo Basaran chủng Candida guilliermondii
sinh tổng hợp hoạt tính AE cao nhất 0.85U/mg sau 60 giờ lên men [129].
Những kết quả về hoạt tính acetyl esterase của chủng nấm X. polymorpha A35 trong nghiên cứu đã đăng trên tạp chí J. Korean Soci. Appl. Biolog. Chem (2015).
Như vậy, kết quả nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase bởi nấm X.
polymorpha A35 cho thấy đây là chủng rất tiềm năng với hoạt tính enzyme cao và thời gian lên men sinh tổng hợp ngắn.
Nguồn nitơ thích hợp:
Cùng với nguồn cacbon, nitơ là một trong những yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp acetyl esterase của nấm trong điều kiện lên men lỏng. Do vậy, mẫu thí nghiệm sử dụng môi trường bổ sung các nguồn nitơ khác