Môi trường BM Môi trường BM+
Dịch đường sau phản ứng chuyển hóa
Dịch đường sau phản ứng chuyển hóa được bổ sung thêm các thành phần từ môi trường Hansen bao gồm: peptone:10 g/l; KH2PO4: 3g/l; MgSO4.7H2O: 3g/l.
Ảnh hưởng thời gian và pH:
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian và pH đến quá trình lên men được tiến hành tại các thời điểm 6, 12, 24, 30, 36, 48, 54, 60, 72, 78, 81 giờ và pH tại
4.3; 4.6; 4.9; 5.2; 5.5, 6.0. Hiệu suất của q trình lên men được đánh giá thơng qua hàm
lượng bioethanol tạo thành và tổng đường khử còn lại trong dung dịch.
Ảnh hưởng nhiệt độ:
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men được tiến
hành ở 230C, 250C, 280C, 300C, 350C và 370C. Nhiệt độ lên men thích hợp được đánh giá thông qua hàm lượng bioethanol sinh ra trong các thí nghiệm.
Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men:
Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 với mật độ 15 x 106 CFU/ml
được sử dụng để bổ sung vào môi trường lên men theo tỷ lệ: 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,
8%, 9% và 10%. Tỷ lệ nấm men thích hợp được đánh giá thông qua hàm lượng bioethanol sinh ra trong các thí nghiệm.
2.2.2. Định danh nấm
2.2.2.1. Định danh nấm bằng phương pháp hình thái giải phẫu
Đối với các chủng nấm mới phân lập sẽ được định tên theo hình thái giải phẫu so
sánh và các tài liệu của Roberts & Evans (2011) [36], Kiệt T.T. (2011) [37] và Jean Polese (2000) [144]. Dựa trên các đặc điểm mũ, phiến và bào tử nấm nhờ: hình dáng,
kích thước, màu sắc và cấu tạo để định danh. Tai nấm được thu nhận quan sát hình thái
bên ngồi và hình thái cắt dọc để xem cách gắn mũ nấm và phiến vào thân, cấu trúc của thân. Quan sát hình thái giải phẫu phiến (phiến cắt ngang) dưới kính hiển vi ở độ phóng
đại 100 lần (X10) và 400 lần (X40). Quan sát hình dạng, kích thước bào tử bằng kính
tiếp xúc với oxy khơng khí bằng cách cắt miếng thạch có tơ nấm cho vào dụng cụ đo là máy Luminestor. Dựa vào chìa khóa phân loại của Jean Marie Polese (2000) để định
danh.
2.2.2.2. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
Tách chiết và tinh sạch ADN tổng số:
ADN tổng số được tách chiết theo protocol CTAB của Doyle (1987) [106] và điện di trên gel agarose 0,8% (80 - 100 V). Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN tổng số bằng thiết bị đo quang phổ ở bước sóng λ = 260 nm và 280 nm. Tinh sạch ADN bằng bộ KIT Fermentas (Thermo Fisher, Waltham, USA) và tiến hành quy trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Nhân gen đích bằng kỹ thuật PCR:
Nhân vùng gen nhân (ITS) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG; ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC [107]. Thành phần mỗi phản ứng PCR có thể tích 25 µl gồm các thành phần: 13 µl d.H2O; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl dNTPs 2,5 mM; 1,25 µl mồi xi (10 pmol/µl); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol/µl); 0,5 µl Taq polymerase (5 U µ/l); 3 µl ADN (10-20 ng).
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 940C trong 3 phút; tiếp sau là 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 940C trong 45 giây, 550C trong 45 giây, 720C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 720C trong 10 phút, giữ sản phẩm ở 40C.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% và tinh sạch bằng Qiaquick Gel
Extraction KIT (Qiagen, CHLB Đức). Sản phẩm này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng giải trình tự trực tiếp hai chiều (mồi xi và mồi ngược) với mồi ITS1/ITS4, sử dụng
BigDye Terminator Cycler v3.1 và đọc kết quả trên hệ thống ABI 3100 Avant Genetic
Analyzer (Applied Biosystems, USA). Trình tự ADN sau khi đọc được hiệu chỉnh bằng
phần mền ChromasPro1.7.6 (Technelysium Pty Ltd., Australia) để loại bỏ các vùng tín hiệu nhiễu. Các trình tự phân tích được sắp xếp thẳng hàng bằng phần mền Bioedit
v7.0.5.2 [108], geneDoc 2.7 [109]. Trình tự nucleotide ITS của các chủng nấm được so sánh với các trình tự đã có trên GenBank, sử dụng phần mền BLAST trong NCBI [110].
Dữ liệu trình tự nucleotide sẽ được khảo sát phân bố nucleotide, kiểm tra các giả
thuyết và xác định mơ hình tiến hóa tối ưu bằng cách sử dụng chuẩn thông tin Akaie
được hiệu chỉnh (corrected AICc-Akaike Information Criterion) trong phần mền
Modeltest v3.7 (Posada 2005). Kết quả khảo sát sẽ được sử dụng làm tham số đầu vào để tính tốn ma trận khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh chủng loại theo các
phương pháp: MP (Maximum Parsimony), ML (Maximum Likelihood) và NJ (Neighbor
Joining).
Xây dựng cây tiến hóa:
Để xây dựng cây tiến hóa theo phương pháp ML, MP và NJ, dữ liệu ADN được
chuyển vào phần mềm Bioedit v7.0.5.2, lustal W [108] , geneDoc 2.7 [109] với các thơng số tiến hóa (giá thị thông số gamma, giá trị tỷ lệ các điểm không biến thiên, giá trị mơ hình tiến hóa,...) được lấy từ kết quả phân tích của mơ hình tiến hóa Modeltest v3.7. Tất cả cây tiến hóa theo 3 phương pháp trên đều được phân tích bằng phần mềm PAUP*4.0 b10 (Swofford, 2003), Mega 6.0.6 [111]. Phần mềm Treview được dùng để hiệu chỉnh hình
ảnh cây tiến hóa.
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm
2.2.3.1. Sàng lọc trên đĩa thạch
Dưới các điều kiện vô trùng, khoanh thạch (Ø 1cm) được cắt từ mơi trường ni
cấy đã có sự phát triển của các sợi nấm và cấy chuyển lên đĩa thạch có mơi trường Kirk [114] bổ sung cơ chất chỉ thị ethyl ferulate (0,1%; w/v) cho hoạt tính feruloyl esterase, thời gian nuôi cấy từ 3-7 ngày. Hoạt độ của esterase được xác định dựa trên vòng phân
giải được tạo thành.
2.2.3.2. Sàng lọc trên môi trường lên men bề mặt và dịch thể
Các chủng nấm lựa chọn được đánh giá khả năng sinh esterase trên môi trường nuôi cấy bề mặt trong bình Erlenmeyer 100 mL có cơ chất giàu lignocellulose (rơm, mùn gỗ…) [113]. Môi trường lên men cơ bản bao gồm các thành phần cần thiết cho sự phát triển của nấm (MgSO4 0,5 g/l; KH2PO4 1,5 g/l; cao nấm men 2,0 g/l và dịch vi lượng 0,01 L). Bổ sung các cơ chất cảm ứng giàu lignocellulose (rơm rạ, cà chua, khoai tây).
Chia đều lượng V=400 ml môi trường lên men cơ bản cho mỗi bình các bình tam giác
Erlenmeyer-1000 ml.
Khoanh thạch (∅ 1cm) có khuẩn ty nấm được cắt và đặt trên đĩa thạch môi trường Kirk [114] cải tiến. Ủ 23-300C cho tới khi khuẩn ty của nấm mọc kín bề mặt đĩa thạch. Kiểm tra sự tinh sạch, khi đó các đĩa thạch có sự phát triển của nấm có thể sử dụng cho ni cấy lên men thu enzyme ở bước tiếp theo. Mỗi bình mơi trường được cấy với 3 khoanh thạch (Ø 1cm; đối với môi trường rắn) hoặc 5-10% (đối với môi trường dịch thể) từ mơi trường ni cấy đã có sự phát triển của các sợi nấm và ủ ở 22-250C trong 25 ngày. Sau mỗi 3-5 ngày, dịch chiết thô từ môi trường nuôi cấy bề mặt hoặc dịch môi trường nuôi cấy lỏng được lấy để đánh giá hoạt tính acetyl esterase và feruloyl esterase (mỗi thực nghiệm được lặp lại 3 lần). Hoạt tính cao nhất trong suốt q trình ni cấy được so sánh giữa các chủng nấm với nhau để lựa chọn được chủng sinh hoạt tính enzyme cao.
2.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt độ enzyme
2.2.4.1. Hoạt độ acetyl esterase
Hoạt tính acetyl esterase được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng
λ=405 nm dựa trên sự tạo thành p-nitrophenol từ p-nitrophenyl acetate. Nồng độ cuối của cơ chất là 1 mM trong đệm phosphate (100mM). Phản ứng diễn ra ở 370C trên phiến vi
lượng 96 giếng trong 10 phút. ρ-Nitrophenol được tính tốn dựa trên đường chuẩn, trong
cùng một loại đệm. Một đơn vị hoạt độ acetyl esterase (U/ml) là lượng enzyme cần thiết
để giải phóng 1 µmol ρ-nitrophenol trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [115].
Hinh 2.1. Đường chuẩn biểu thị liên hệ giữa mật độ quang và nồng độ ρ-Nitrophenol
y = 0.0012x + 0.3532 R² = 0.9966 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0 50 100 150 200 250 M ậ t độ q ua n g ( O D ) Nồng độ ρ-Nitrophenol(μM)
2.2.4.2. Hoạt độ feruloyl esterase
Hoạt tính feruloyl esterase được xác định dựa trên khả năng đề methyl hóa methyl ferulate (MFA; 1mM) thành axít ferulic trong đệm MOPS (3-(N-morpholino)
propanesulfonic axít). Đây là phương pháp chuẩn để xác định hoạt tính feruloyl esterase trong quá trình nghiên cứu. Phản ứng được bắt đầu bằng ủ hỗn hợp enzyme trong thời gian thích hợp (10-30 phút, phụ thuộc vào mẫu enzyme), sau đó dừng phản ứng bằng thêm acetic/acetonitrile (11,3%) với thể tích tương đương. Sau khi ly tâm, sản phẩm phản
ứng là axít ferulic được phân tích bằng HPLC sử dụng cột pha đảo C18 và sử dụng đầu dò
DAD (=323 nm) Một đơn vị hoạt độ enzyme (U/ml) là lượng feruloyl esterase cần thiết
để giải phóng 1 µmol axít ferulic trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [60].
2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase
2.2.5.1. Xác định nguồn nitơ và cơ chất giàu lignocellulose
Môi trường cơ bản bao gồm các thành phần: MgSO4 0,5 g/l; KH2PO4 1,5 g/l; cao nấm men 3,0 g/l; dịch vi lượng 0,01 L và bổ sung 2% (w/v) cơ chất giàu lignocellulose
và cơ chất ester khác nhau như: cà chua (CC), bã ngô (BN), đậu tương (ĐT), rơm (RR),
khoai tây (KT) và mùn gỗ. Các cơ chất trên đều được rửa sạch, nghiền nhỏ (kích thước dài 0,5-0,7 cm), sấy khơ, trước khi bổ sung vào bình nón (250 mL) chứa mơi trường cơ bản và khử trùng (1210C trong 30 phút).
Sử dụng môi trường với thành phần như trên, tuy nhiên cao nấm men được thay bằng các nguồn nitơ khác nhau: KNO3 3,0 g/l, (NH4)2SO4 3,0 g/l, pepton 3,0 g/l, NaNO3 3,0 g/l để xác định khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau.
Nấm được nuôi cấy ở điều kiện thích hợp trong các bình Erlenmeyer 1000 mL hoặc trên thiết bị lên men 2,5 L (Mumbai, Ấn Độ) trong điều kiện có sục khí 1 lít/phút và lắc khuấy liên tục (200 v/ph). Cứ 3 ngày lấy 1 ml mẫu để xác định hoạt tính enzyme và sự thay đổi pH môi trường, thực nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thể hiện là giá trị trung bình của các lần thực nghiệm lặp lại.
2.2.5.2. Xác định nhiệt độ, pH thích hợp
Chủng nấm được nuôi cấy trên môi trường cơ bản (pH 6,5) bổ sung cơ chất (2%) và nguồn nitơ thích hợp. Nhiệt độ và pH tối ưu của esterase được xác định bằng
cách đo hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên sử dụng đệm acetate 100
mM (pH 5,0-5,5) và đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8,0), nhiệt độ thay đổi từ 23- 370C và pH từ 5,0-8,0.
2.2.6. Tinh sạch protein enzyme
2.2.6.1. Tách chiết, tinh sạch protein enzyme
Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được tách chiết bằng nước cất
(đối với môi trường rắn) qua đêm và lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc. Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng thiết bị ly tâm 5000-10.000 v/ph và
hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off (LongerPump K235 với màng UFP 10MW, Amersham BioScience, Westborough, Mỹ, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, Millipore, Bedford, Mỹ) ở 110C.
Dịch enzym thơ biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký
trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với đệm Na-acetate 10mM và nồng độ NaCl từ 0-2,5 M hoặc cột Superdex 75, đệm Na-acetate 50 mM. Protein rửa giải được xác định sử dụng đầu dị ở bước sóng λ=280nm. Các phân đoạn có hoạt tính esterase được gộp chung, cơ loại bớt
dịch và hịa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu được lưu giữ ở -200C.
Hinh 2.2. Hệ thống siêu lọc 10 kDa cut-off trên thiết bị amicon Ultra Centrifugal Filters
2.2.6.2. Xác định hàm lượng protein
Nồng độ protein tổng trong dịch chiết và các phân đoạn tinh sạch được xác định bằng phương pháp so màu theo quy trình của Bradforf (1976) [116] sử dụng Roti® - Nanoquant Kit và protein chuẩn BSA (bovine serum albumin). Mẫu được nhỏ lên phiến
96 giếng, lặp lại 3 lần và đo ở bước sóng λ=590/450nm với thiết bị đo phiến vi lượng NanoQuant (Tecan, Grӧdig, Austria).
Độ tinh sạch cũng như trọng lượng phân tử và điểm đẳng điện của protein enzyme được đánh giá bằng phương pháp điện di SDS-PAGE và IEF.
2.2.6.3. Điện di trên gel polyacrylamide có SDS
Điện di SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất với hệ điện di đứng (XCell SureLockTM
Mini-Cell, Invitrogen, Karlsruhe, CHLB Đức hoặc OmniPage Mini; Cleaver Scientific, Warwickshire, Anh) và NuPAGE® 12% Bis Tris Gels (Invitrogen). Phương pháp này
được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch của protein dưới điều kiện biến tính cũng như xác định trọng lượng phân tử (MW) của protein enzym [117]. Hỗn hợp protein (MW 6,5-200 kDa; Serva, Heidelberg, CHLB Đức) được sử dụng làm protein chuẩn. Protein phân tách điện di được quan sát sau khi nhuộm với Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen).
2.2.6.4. Điện di điểm đẳng điện
Các hệ điện di ở trên cũng được sử dụng để phân tách protein dựa trên điểm đẳng
điện (pI) của chúng. Điều kiện điện di được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất
với gel Novex® Pre-Cast Vertical IEF (gradient pH 3,0-7,0) và Liquid Mix IEF Marker (pH 3.0-10.0; Serva, Heidelberg, CHLB Đức). Các dải protein trên gel polyacrylamide sau đó được quan sát sử dụng nhuộm với Colloidal Blue Staining Kit (Invitrogen).
2.2.6.5. Xác định nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme tinh sạch
Nhiệt độ và pH tối ưu của acetyl esterase tinh sạch được xác định bằng cách đo hoạt tính enzyme theo phương pháp đã mơ tả ở mục 2.2.4 sử dụng đệm acetate 100 mM (pH 3,0-5,5) và đệm phosphate 100 mM (pH 5,5-8,0), nhiệt độ thay đổi trong khoảng 35- 700C tại pH 5 và pH từ 4,0-7,0 ở 400C.
pH tối ưu của feruloyl esterase tinh sạch được xác định trong bộ đệm MOPS (100 mM) ở pH từ 4 đến 9. Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng cách thủy phân methyl ferulate
2.2.6.6. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của enzyme tinh sạch
Để đánh giá độ bền nhiệt và độ bền pH của acetyl esterase tinh sạch, dịch enzyme
(250 µl cho mỗi phản ứng) được ủ ở nhiệt độ 400C và 600C tại pH 5,0 và giá trị pH 3; pH 5 và pH 6 (pH 3,0-6,0 với đệm acetate; pH 6,0-8,0 với đệm phosphate) ở 400C, Xác định hoạt tính sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6, và 8 giờ. Hoạt tính cịn lại của enzyme acetyl esterase tinh sạch cũng được xác định theo phương pháp ở mục 2.2.4.
Sự ổn định pH của feruloyl esterase đã tinh sạch được thử nghiệm trong dung dịch citrate-phosphate (50 mM) ở pH 5.0, 7.0, 8.0 và 10.0 ở 400C. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định enzyme được nghiên cứu ở 400C và 600C trong đệm MOPS (100 mM, pH
6,0). Sau khoảng thời gian ủ tại 2, 4, 6 và 8 giờ các mẫu thử nghiệm được lấy ra và hoạt
động feruloyl esterase cịn lại được đo như mơ tả mục 2.2.4.
2.2.7. Phương pháp hóa sinh
2.2.7.1. Sắc ký bản mỏng
Sản phẩm của phản ứng chuyển hóa là các đường đơn được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC) sử dụng hệ dung môi: n-butanol: aceton: H2O (8:1:2). Thuốc thử là H2SO4 (5-10%) được sử dụng để xác định vết chất đường trên bản mỏng [118].
Chất chuẩn là các đường D-glucose, D-galactose, D-xylose và D-mannose (SigmaAldrich- Mỹ) pha trong nước cất với nồng độ 0,1mg/ml. Mỗi chất được chấm lên một điểm hoặc theo đường được đánh dấu vị trí trên bản sắc kí mỏng TLC để xác định vị trí Rf.
2.2.7.2. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Để xác định thành phần và hàm lượng các đường đơn trong dung dịch chuyển hóa,
hỗn hợp phản ứng được ly tâm nhanh ở 12000 v/ph và chuyển sang các ống HPLC thể
tích 1,5 mL. Glucose được đo nồng độ bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử
dụng pha động là axít sulfuric 0,01 N. Mẫu và chất chuẩn được chạy ở nhiệt độ cột: 600C, tốc độ pha động 1 ml/phút. Dựa trên khả năng phân bố khác nhau của các cấu tử khác nhau trên cột, khi dung môi rửa giải đi qua, các cấu tử sẽ lần lượt được rửa giải ra khỏi cột theo thứ tự tùy thuộc vào bản chất của các cấu tử. Những cấu tử như nhau (thuộc cùng một chất) sẽ có thời gian lưu như nhau, nhờ vào đó máy HPLC có thể tách hỗn hợp
nhiều chất ra khỏi nhau. Do diện tích bề mặt tiếp xúc của pha tĩnh lớn, HPLC có độ phân
tách khá cao. Căn cứ vào thời gian lưu của từng chất và so sánh với chất chuẩn, có thể kết
luận về thành phần các chất có trong dung dịch mẫu. Nếu cần có thể xác định bằng cách thêm chuẩn vào mẫu. Để phân tích các đường đơn (glucose, mannose, galactose) sử dụng cột sắc ký ion-exclusion RezexTM (RPM-Monosaccharide Pb+2 (8%) 7.8 mm x 300 mm, Phenomenex), cột này có thể đo đường, axít hữu cơ và cồn, sử dụng đầu dò chỉ số khúc xạ (RI).