Các bước thực thiện: Xử lý cơ học:
Bã mía sau thu hoạch được xử lý cơ học bằng cách xấy khô, xử lý bằng cách nghiền nhỏ bằng hệ thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) và lọc qua rây để đạt được kích thước khoảng 0,5 – 1,0 mm. Việc nghiền nhỏ với mục đích
phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa axít và cơ chất. Tạo điều kiện cho quá trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất.
Xử lý bằng axít H2SO4:
Bã mía (10%; w/v) được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch H2SO4 loãng ở
nồng độ 0,1% và ủ ở 850C trong 2,5 giờ. Mục đích q trình xử lý này giúp tách loại một phần lignin, phá vỡ cấu trúc phức tạp và tăng khả năng xúc tác trên cấu trúc phân tử
cellulose. Bên cạnh đó, quá trình xử lý hóa học cịn thủy phân hemicellulose có trong thành phần sinh khối. Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với những chuỗi mạch ngắn
hơn so với cellulose. Do đó, việc thủy phân hemicellulose dễ dàng hơn thủy phân cellulose. Hemicellulose bị thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân tiếp xúc thủy phân cellulose bằng “enzyme cocktail” ở quá trình kế tiếp.
Điều chỉnh pH:
Điều chỉnh dung dịch sau chuyển hóa về pH 5 nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho hỗn hợp “enzyme cocktail” chuyển hóa sinh học.
Bổ sung hỗn hợp “enzyme cocktail”:
Dịch chuyển hóa sau khi điều chỉnh về pH 5 tiếp tục được thủy phân bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” với thành phần bao gồm: Cell/Xyl: 100-160 U/gds, AltFAE: 7,56
U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds, hỗn hợp được ủ ở 400C, pH 5, thời gian ủ 48 giờ trong điều kiện có khuấy đảo liên tục 200 vòng/phút.
Bất hoạt enzyme cocktail:
Dịch sau thủy phân được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy ở 90oC trong
10 phút để dừng phản ứng chuyển hóa.
Lọc bỏ cặn bã mía đã thủy phân bằng cách lọc và ly tâm. Dịch sau q trình
chuyển hóa được đem đi xác định tổng hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
Bổ sung thành phần dinh dưỡng:
Sau q trình chuyển hóa dịch đường thu được bổ sung thêm một số thành phần
dinh dưỡng trong môi trường Hansen.
Điều chỉnh pH môi trường lên men:
Điều chỉnh pH 5.2 trong môi trường lên men bioethanol, cơng đoạn này nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 phát triển.
Lên men bioethanol:
Để lên men bioethanol hiệu quả, quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ
280C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men bổ sung 5%, môi trường lên men là dịch đường sau chuyển hóa được bổ sung thêm các thành phần từ môi trường hansen.
Chưng cất thu nhận bioethanol:
Kết thúc quá trình lên men tiến hành đo nồng độ bioethanol tạo thành trong dung dịch bằng hệ thống chưng cất phân đoạn nhằm nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm bioethanol tạo thành. Bioethanol được bảo quản trong bình kín, thống gió, tránh ánh sáng và các nguồn nhiệt.
Xác định tổng hàm lượng đường khử còn lại trong dung dịch sau lên men:
Sau khi kết thúc quá trình lên men trong dung dịch sẽ còn một lượng nhất định
đường khử (nhóm đường pentose) mà nấm men chưa hoặc không tiêu thụ được. Để đánh
giá hiệu suất của quá trình lên men ngồi việc xác định hàm lượng bioethanol tạo thành thì việc xác định hàm lượng đường còn lại (chưa lên men) là cần thiết.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu trên rút ra những kết luận như sau:
1. Phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota). Từ đó, sàng lọc được chủng nấm Xylaria polymorpha
A35 (135,4 U/l) có khả năng sinh tổng hợp acetyl esterase và chủng Alternaria tenuissima SP66 (1154,4 U/l) có khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase cao.
2. Feruloyl esterase tinh sạch từ nấm Alternaria tenuissima SP66 (AltFAE) có trọng
lượng phân tử Mw = 30,3 kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 11,2 U/mg, enzyme hoạt động
tối ưu ở 420C, pH 7,0 và bền ở pH 5,0. Acetyl esterase tinh sạch từ nấm Xylaria polymorpha A35 (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa, hoạt tính đặc hiệu
đạt 13,1 U/mg, enzyme hoạt động tối ưu ở 420C, bền ở pH 5.0.
3. Bã mía được lựa chọn là nguyên liệu nghiên cứu phù hợp khi sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” thủy phân. Áp dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm đã xác định
được điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail” để chuyển hóa bã mía (10%,
w/v) thành các đường lên men được thực hiện ở nhiệt độ 400C, pH 5,0, thời gian ủ 48 giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến xác định được phương trình quy hồi mơ tả hiệu quả q trình thủy phân biểu thị thơng qua tổng hàm lượng đường khử tạo thành phụ thuộc vào thành phần và hoạt độ (x) của các “enzyme cocktail” [Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2) và XpoAE (x3)] tham gia chuyển hóa có dạng:
y = 206,946 + 29,954x
1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 2 1
x tương ứng với
hoạt độ (U) của “enzyme cocktail” trên 1 gram cơ chất bã mía sử dụng là Cell/Xyl:
100 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds với giá trị Ymax = 251,86
mg/g.
4. Quá trình chuyển hóa bã mía được thực hiện ở điều kiện tối ưu bằng cách kết hợp
giữa xử lý hóa học bằng acid H2SO4 loãng ở nồng độ 0,1%, ủ trong 2,5 giờ, ở 850C và xúc tác sinh học bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” . Khi đó, tổng hàm lượng đường khử sinh ra đạt 319,5 mg/g cơ chất, hiệu suất chuyển hóa từ bã mía thành đường đạt
49,8%. Trong đó, nồng độ glucose và xylose tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g,
các đường lên men khác chiếm khoảng 18%.
5. Q trình lên men bioethanol thích hợp ở nhiệt độ 280C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men 5% trong môi trường với thành phần là dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm các chất dinh dưỡng trong môi trường Hansen. Trong điều kiện này, hàm lượng bioethanol tạo thành là 14,088g/l, hiệu suất lên men bioethanol từ bã
mía đạt 0,141 gram/gram, tương ứng 178ml bioethanol/kg bã mía. Hiệu suất lên men từ dịch đường chuyển hóa đạt 79,8% so với lý thuyết. Điều này chứng minh cho khả
năng chuyển hóa bã mía bằng xúc tác sinh học thành dịch đường có khả năng lên men thành bioethanol.
KIẾN NGHỊ
Để ứng dụng sản xuất enzyme thủy phân nói chung, feruloyl esterase và acetyl esterase nói riêng trên quy mơ cơng nghiệp thì việc nghiên cứu tăng năng suất sinh tổng hợp hai enzyme này là cần thiết. Do đó, với những kết quả về xác định một số
đoạn peptide của enzyme tinh sạch, chúng tôi kiến nghị hướng nghiên cứu tiếp theo là biểu hiện gen mã hóa cho feruloyl esterase và acetyl esterase tinh sạch từ hai chủng nấm Alternaria tenuissima SP66 và Xylaria polymorpha A35 để sản xuất
DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
A. Tạp chí quốc tế (SCIE):
1. Do Huu Nghi, René Ullrich, Franco Moritz,Le Mai Huong, Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Martin Hofrichter, Christiane Liers. The Ascomycete Xylaria polymorpha Produces an Acetyl Esterase That Solubilises Beech Wood Material to Release Water-soluble Lignin Fragments. Journal Korean Soci Appl Biol Chem,
2015, 58 (3), 415-521.
2. D.H. Chi, V.D. Giap, L.P.H. Anh, and D.H. Nghi. An feruloyl esterase from Alternaria tenuissima that hydrolyses lignocellulosic material to release hydroxycinnamic acids. Applied Biochemistry and Microbiology, 2017, 53, (6),
654:660.
B. Tạp chí chuyên ngành trong nước:
1. Đỗ Hữu Nghị, Vũ Đình Giáp và Đỗ Hữu Chí. .Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme axetyl (xylan) esterase của nấm Aureobasidium pullulans Var melanigenum SH1 trên cơ chất là các phụ phẩm công-nông nghiệp giàu-lignicellulose. Tạp chí
nơng nghiệp và phát triển nông thôn – kỳ 2 tháng 3/2016, 56-62.
2. Vũ Đình Giáp, Đỗ Hữu Chí, Lê Mai Hương, Đỗ Hữu Nghị. Nghiên cứu sinh tổng hợp
feruloyl esteraza bởi nấm trên môi trường nuôi cấy lỏng với cơ chất giàu lignoxelluloza. TC Nông nghiệp & PTNT, 2016, 12, 103:110.
3. Đỗ Hữu Nghị, Lê Mai Hương, Lê Thị Bích Thảo, Vũ Đình Giáp, Nguyễn Trung Hiếu, Đỗ Hữu Chí. Feruloyl esterase từ chủng nấm Alternaria tenuissima và khảo sát
hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm phản ứng enzyme. Tạp chí Y học VN, 2016,
445, 143:148.
4. Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Pham Hong Hai, Tang Thi Chinh, Do Huu Nghi. Using
experimental planning to optimize the hydrolysis of sugar cane bagasse into fermentable sugars for bioethanol production by fungal enzyme mixture. Vietnam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. P. Kumar, M. Diane, J.L. Delwiche and P. Stroeve. Methods for Pretreatment of
Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production.
Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48 (8), 3713–3729.
2. G. Cao, X. Zhang, S. Gong, F. Zheng. Investigation on emission factors of
particulate matter and gaseous pollutants from crop residue burning, Environ.
Sci., 2008, 20, 50 - 55.
3. Nguyễn Văn Vinh, Bùi Minh Trí, Hyeun Jong Bae. Đánh giá chất lượng một số
loại sinh khối thải từ mía, sắn và ảnh hưởng của kỹ thuật tiển xử lí nhằm chuyển hóa thành cồn sinh học. Tạp chí sinh học, 2014, 36 (1se), 301-306.
4. H. Jorgensen, J. Bach Kristensen, C. Felby. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities, Biofuel.
Bioprod. Bior., 2007, 1, 119-134.
5. Y. Fukushima, B. Monties. Occurence, function and biosynthesis of lignins, Wiley-VCH, Weinheim, Biopolymers, 2001,1, 1-64.
6. S. Kim, B.E. Dale. Global potential bioethanol production from wasted crops and
crop residues, Biomass Bioener., 2004, 26, 361-375.
7. H. Lilholt, M.J. Lawther. Natural organic fibres. Comprehensive composite materials, Elsevier Science, 2000, 1, 303-325.
8. Hồ Sĩ Tráng. Cơ sở hoá học gỗ và cellulose, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, 30-81.
9. S. Park, O.J. Baker, M.E. Himmel, D.K. Parilla, P.A. Johnson. Cellulose crystallinity index: measurement techniques and their impact on interpreting cellulase performance. Biotechnol., Biofuels, 2010, 3, 1–10.
10. Nguyễn Thị Ngọc Bích. Kỹ thuật cellulose và giấy, Nhà xuất bản Đại học Quốc
11. W.R. De Souza. Microbial degradation of lignocellulosic biomass, Chandel A, Da Silva, S. Sustainable degradation of lignocellulosic biomass techniques, applications and commercialization. Brazil: InTech, 2013.
12. F.M. Girio, C. Fonseca, F. Carvalheiro, L.C. Duarte, S. Marques, R. Bogel-
Łukasik. Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Bioresource Technology, 101, (13), 2010, 4775-4800.
13. R. Alen. Structure and chemical composition of wood In: Stenius P., editor. (Ed.), Forest Prod Chem. Helsinki: 2000, 12–57.
14. Hetti Palonen. Role of lignin in the enzymatic hydrolysis of lignocellulose, VTT
Biotechnology, 2004, 11-39.
15. A. Hatakka. Biodegradation of lignin. Biopolymers: Lignin, humic substances and coal, 2001, 1, 129-180.
16. Y.L. Lin, C.W. Dence. In: Methods in lignin chemistry. 1st ed. New York:
Springer-Verlag Berlin, 1992.
17. http://www.pvn.vn/?portal=news&page=detail&category_id=11&id=516, 11/6/2018.
18. Lê Quang Diễn, Phạm Tuấn Anh, Tô Kim Anh, Nguyễn Thị Minh Nguyệt. Thu nhận xenlulozơ từ bã mía cho sản xuất ethanol sinh học theo phương pháp xử lý với axit axetic. Tạp chí hóa học, 2015, 53 (1), 50-55.
19. https://www.mard.gov.vn/Pages/hoi-nghi-tong-ket-san-xuat-nien-vu-mia-duong- 2016-2017.aspx, 29/6/2018.
20. A. Pandey, C.R. Soccol, P. Nigam, V.T. Soccol. Biotechnological potential of agro-industrial residues. I. Sugarcane bagasse, Bioresour. Technol., 2000, 74,
69-80.
21. A.P. Fernandes, C.A. Alves, C. Gonc¸alves, L. Tarelho, C. Pio, C. Schimdlb và H. Bauerb. Emission factors from residential combustion appliances burning Portuguese biomass fuels, Journal of Environmental Monitoring, 13, 2011, 3196-
22. J.S. Van Dyk, B.I. Pletschke. Lignocellulose bioconversion using enzymatic hydrolysis and synergistic cooperation between enzymes--factors affecting enzymes, conversion and synergy. Biotechnol., 2012, 30, 1458-1480.
23. M. Latha Gandla, C. Martín and J. Jönsson. Analytical Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass for Conversion to Biofuels and Bio- Based Chemicals. Energies. 2018, 11, 2936.
24. C. Martin, B. Alrikkson, A. Sjode, N. Nilverbant, L.J. Jonsson. Dilute sulphuric acid pretreatment of agricultural and agro-industrial residues for ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol., 2007, 136, 339–352.
25. I. Cybulska, H. Lei, J. Julson, Hydrothermal pretreatment and enzymatic hydrolysis of Prairie cord grass. Energy Fuels, 2010, 24, 718–727.
26. Y. Sun, J. Cheng. Hidrolysis of lignocellulosic bagasses for ethanol production: a
review. Bioresour. Technol., 2002, 83, 1–11.
27. J.D. McMillan, M.E. Himmel, J.O. Baker, R.P. Overend, Pretreatment of lignocellulosic biomass. In: Enzymatic ConVersion of Biomass for Fuels Production; American Chemical Society: Washington, DC, 1994, 292-324.
28. M.J. Taherzadeh, K. Karimi. Acid-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials: a review, Bio Resour., 2007, 2, 472-499.
29. Zhanying Zhang, Ian M. O’Hara, Sagadevan Mundree, Baoyu Gao, Andrew S Ball, Nanwen Zhu, Zhihui Bai and Bo Jin. Biofuels from food processing wastes, Current Opinion in Biotechnology, 2016, 38, 97–105.
30. K. Kucharska, P. Rybarczyk, I. Hołowacz, R. Łukajtis, M. Glinka and M. Kaminski. Pretreatment of Lignocellulosic Materials as Substrates for Fermentation Processes. Molecules, 23(11), 2018, 29-37.
31. L. Keikhosro Karimi. Mohammad, Taherzadeh. Pretreatment of Lignocellulosic Wastes to Improve Ethanol and Biogas Production, International Journal of Molecular Sciences, 2008, 9, 1621-1651.
32. R.A. Silverstein, Y. Chen, R.R. Sharma-Shivappa, M.D. Boyette, J. A. Osborne.
Comparison of chemical pretreatment methods for improving saccharification of cotton stalks. Bioresour. Technol., 2007, 98, 3000-3011.
33. B.C. Saha, B.I. Loren, M.A. Cotta, Y.V. Wu. Dilute acid pretreatment, enzymatic
saccharification and fermentation of wheat straw to ethanol. Process Biochem.,
2005, 40, 3693-3700.
34. Trần Đình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải. Động học các quá trình xúc tác sinh học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 2005.
35. D.B. Wilson. Cellulases and biofuels. Curr. Opi. Biotechnol., 2009, 20, 295-299. 36. P. Roberts, S. Evans. The Book of Fungi: A Life-Size Guide to Six Hundred
Species from around the World. University of Chicago Press, Chicago and
London, UK, 2011.
37. Trịnh Tam Kiệt. Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, 1 (Tái bản lần thứ 2), 2011.
38. C. Liers, R. Ullrich, K.T. Steffen, A. Hatakka, M. Hofrichter. Mineralization of 14C-labelled synthetic lignin and extracellular enzyme activities of the wood- colonizing ascomycetes Xylaria hypoxylon and Xylaria polymorpha. Appl
Microbiol Biotechnol., 2006, 69 (5), 573-579.
39. D.W. Wong. Feruloyl esterase: a key enzyme in biomass degradation. Appl.
Biochem. Biotechnol., 2006, 133, 87-112.
40. H. Mori, K. Kawabata, N. Yoshimi. Chemopreventive effects of ferulic acid on
oral and rice germ on large bowel carcinogenesis. Anticancer Res., 1999, 19,
3775-3778.
41. Yang Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu and Jia Xun Feng. Isolation, screening
and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of china and optimization of cellulose production by Paenibacillus terrae ME27-1. BioMed Research International, 2014, 2014, 497-512.
42. Dương Minh Lam, Đỗ Đức Quế, Trần Huyền Trang. Thành phần loài Xylaria ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, Ninh Bình. Báo cáo số 135, 4th National conference
on ecology and biological resources, 2011, Hanoi.
43. Parveen Kumar, M. Diane Barrett, J. Michael Delwiche and Pieter Stroeve.
Methods for Pretreatment of Lignocellulosic Biomass for Efficient Hydrolysis and Biofuel Production. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2009, 48 (8),
3713–3729.
44. P. Elba, S. Bon, Maria Antonieta Ferrara. Bioethanol production via enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. FAO seminar held in Rome, 2015, 58 (3), 415-
521.
45. D. Peters. Raw materials. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, 2007, 105, 1-30. 46. H. Lee, R.J. To, R.K. Latta. Some properties of extracellular acetylxylan esterase
produced by the yeast Rhodotorula mucilaginosa. Appl. Environ. Microbiol.,
1987, 53, 2831-2834.
47. T. Juha´sz, Z. Szengyel, K. Re czey, M. Siika-Aho, L. Viikari. Characterization
of cellulases and hemicellulases profuced by Trichoderma reesei on various carbon sources. Process Biochem., 2005, 40, 3519 – 3925.
48. Martina Andlar, Tonci Rezi, Nenad Marđetko, Daniel Kracher, Roland Ludwig,
Bozidar Santek. Lignocellulose degradation: An overview of fungi and fungal enzymes involved in lignocellulose degradation. Engineering in Life Sciences.
Eng. Life Sci. 2018, 0, 1–11.
49. J.R.K. Cairns and A.Esen. β-Glucosidases, Cellular and Molecular Life Sciences, 2010, 67 (20), 3389-3405.
50. F. Haagensen, B.K. Ahring. Enzymatic hydrolysis and glucose fermentation of wet oxidized sugarcane bagasse and rice straw for bioethanol production,
Environment Microbiology & Biotechnology Research Group, Technical University of Denmark.
51. H. Punnapayak, G.H. Emert. Use of pachysolen tannophilus in simultaneous Saccharification and Fermentation (Ssf) of lignocelluloslcs. Biotechnol. Lett,,
1986, 8, 63-66.
52. M. Dashtban, H. Schraft, and W. Qin. Fungal bioconversion of lignocellulosic residues; opportunities & perspectives, International journal of biological
sciences, 2009, 4, 5(6), 578-595.
53. A. Chana, and T. Satyanarayana. Xylanase production by thermophilic Bacillus
licheniformis A99 in solid-state fermentation, Enzyme and Microbial Technology,
2009, 21 (1), 12-17.
54. M. Taniguchi, H. Suzuki, D. Watanabe, K. Sakai, K. Hoshino and T. Tanaka.
Evaluation of pretreatment with Pleurotus ostreatus for enzymatic hydrolysis of rice straw, Journal of bioscience and bioengineering, 2005, 100 (6), 637-643.