(1) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS
(i) Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới khảnăng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Dịch tinh bột với các nồng độ 5; 7,5; 10; 12,5 và 15% (w/v, tính theo chất khơ)
pha trong đệm acetate 0,2M pH 5,0. Đun cách thủy 30 phút để hỗn hợp được hồ hóa
hồn tồn, sau đó làm mát nhanh dưới vòi nước để đưa về nhiệt độ 55°C, bổ sung enzyme pullulanase nồng độ 30 U/g và duy trì trong thời gian 4 giờ. Kết thúc phản
ứng bằng cách đun sôi hỗn hợp trong 30 phút. Tiến hành xác định khảnăng tiêu hóa
của hỗn hợp thu được. Lựa chọn được nồng độ tinh bột CP % đem lại hiệu quả nhất trong việc tạo SDS.
45
Giữ nguyên các thơng số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ tinh bột được lựa chọn và nồng độ enzyme pullulanase bổ sung lần lượt là 10; 20; 30; 40; 50 U/g. Nồng độ enzyme Pp U/g cho hiệu suất SDS cao nhất được lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
(iii) Ảnh hưởng của pH tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ enzyme pullulanase được lựa chọn và pH lần lượt là 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Thu được sản phẩm thủy phân và tiến hành xác định khả năng tiêu hóa. Lựa chọn
được điều kiện pHp cho hàm lượng SDS lớn nhất.
(iv) Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khi thủy phân bởi pullulanase
Giữ nguyên các thông sốđiều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉthay đổi pH
được lựa chọn và nhiệt độ lần lượt là 45; 50; 55; 60; 65 oC. Thu được sản phẩm thủy phân và tiến hành xác định khảnăng tiêu hóa. Dựa trên hàm lượng SDS, lựa chọn
được Tp °C là điều kiện tốt nhất cho quá trình thủy phân.
(v) Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới khảnăng tiêu hóa của tinh bột
Giữ nguyên các thơng số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và lấy mẫu tại các thời điểm từ1 đến 8 giờ (sau mỗi 1 giờ). Tiến hành xác định khảnăng tiêu hóa của sản phẩm thủy phân thu được. Lựa chọn
được thời gian tp giờ là thời điểm cho hàm lượng SDS cao nhất mà vẫn đảm bảo tiết kiệm năng lượng.
(2) Nghiên cứu chế độ thối hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng SDS
Chếđộ thối hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase đểgia tăng hàm lượng SDS
được nghiên cứu qua 3 lần thối hóa.
(i) Ảnh hưởng của nhiệt độ thối hóa lần 1 đến khả năng hình thành tinh bột tiêu hóa chậm
Gel thu được sau quá trình thủy phân được bảo quản ở các nhiệt độ -20℃, -
10℃, 4℃ và 25℃ trong thời gian 48 giờ để q trình thối hóa được diễn ra. Thông số khảo sát được lựa chọn liên quan đến nhiệt độ bảo quản thực phẩm trên thực tế. Khi hoàn thành, đem hỗn hợp ly tâm với tốc độ 3660 rpm trong vòng 10 phút, đổ bỏ dịch trong, sau đó bổ sung nước cất để rửa phần cặn thu được, lặp lại 2 lần. Kết tủa cuối cùng đem sấy ở 40oC trong khoảng 24 giờ để độ ẩm đạt nhỏ hơn
10% và đem nghiền nhỏ, rây qua rây No120. Tiến hành xác định khả năng tiêu hóa
của các mẫu bột thu được. Nhiệt độ thối hóa TTH1 ℃ được lựa chọn tạo điều kiện tốt nhất cho sự hình thành SDS.
(ii) Ảnh hưởng của thời gian thối hóa lần 1 đến hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm Thí nghiệm được tiến hành tương tự ở TTH1℃ trong thời gian từ 12 giờ đến 60 giờ và lấy mẫu sau mỗi 12 giờ để xác định khả năng tiêu hóa của sản phẩm. Thời gian tTH1 giờđược lựa chọn để thực hiện thối hóa khi tạo hàm lượng SDS lớn nhất.
46
Sau thối hóa lần 1, các mẫu được đem đi đun sôi trong 30 phút và tiến hành khảo sát ảnh hưởng của lần thối hóa thứ hai và thứba đến sự hình thành SDS. Từ đó, kết luận được ảnh hưởng của cơng đoạn thối hóa đến sự hình thành SDS cùng với điều kiện về nhiệt độ và thời gian thực hiện thối hóa tương ứng.
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
Hình 2.3: Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp phân đoạn
(1) Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hiệu quả tổng hợp IMO
Đểđánh giá ảnh hưởng của quá trình thủy phân tinh bột trước khi đưa dịch vào
giai đoạn gắn nhánh đến khảnăng tổng hợp IMO, tiến hành tạo các dịch thủy phân có mức độ thủy phân (DE) khác nhau và thực hiện gắn nhánh các dung dịch đã
chuẩn bị. Dịch tinh bột 25% (w/v) được thủy phân bằng α- amylase (1,0 CU/g) và
β-amylase (8 U/g) trong các khoảng thời gian khác nhau. Dịch sau thủy phân sau đó được đem gắn nhánh bằng enzyme transglucosidase nồng độ 15 U/g trong điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 5,0 trong thời gian 12 giờ. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch sản phẩm bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE
47
Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI và tính tốn hàm lượng IMO234 là tổng của hàm lượng IMO2, IMO3 và IMO4. Từ đó, đánh giá được điều kiện cần thiết về mức độ thủy phân tinh bột khoai lang trước khi đưa vào tổng hợp IMO sử dụng enzyme transglucosidase.
(2) Lựa chọn chế phẩm Alpha amylase phù hợp cho q trình dịch hóa
Lựa chọn chế phẩm alpha amylase phù hợp cho q trình dịch hóa dựa trên xác
định thành phần oligosaccharide được tạo thành sau thủy phân bởi các chế phẩm Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS. Các thí nghiệm được tiến hành ở cùng nồng độ cơ chất là 25% (tính theo khối lượng tinh bột khơ), pH 5,8 (đệm acetate 0,2M), nhiệt độ phản ứng là 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) thời gian phản
ứng 30 phút, nồng độ enzyme alpha amylase 1 CU/g. Lặp lại thí nghiệm 2 lần. Hỗn hợp thu được sau dịch hóa đem xửlý, xác định thành phần oligosaccharide bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI và hàm lượng tinh bột sót bằng
phương pháp xác định carbohydrate tổng số. Từ đó chọn được chế phẩm enzyme phù hợp nhất với hàm mục tiêu: Hàm lượng DP 1-10 (% w/w), DP 2-6 (% w/w) lớn nhất; tinh bột sót thấp.
(3) Nghiên cứu các thơng số của q trình dịch hóa tinh bột khoai lang sử dụng enzyme α-amylase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến q trình dịch hóa tinh bột khoai lang, tiến hành thay đổi các nồng độ tinh bột lần lượt là 15%, 20%, 25%, 30%, 35% w/v (tính theo chất khơ). Các thơng số còn lại được cố định bao gồm nhiệt độ 80°C, pH 5,0 (đệm acetate 0,2M), nồng độα-amylase 0,5 CU/g cơ chất khô và thời gian phản ứng 30 phút. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm axit lactic đặc
đến pH 3,0. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định
đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng độ tinh bột= Ci cho khả năng thủy phân hiệu quả nhất.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độđến q trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ tinh bột được lựa chọn và nhiệt độ lần lượt là 70, 75, 80, 85, 90°C. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nhiệt
độ= Ti cho khảnăng thủy phân hiệu quả nhất.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến q trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độđược lựa chọn và lần lượt điều chỉnh pH bằng axit lactic và NaOH 5N đến 4,5, 5,0, 5,5, 5,8, 6,0, 6,5. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng
đường khử DE. Chọn được pHi cho khảnăng thủy phân hiệu quả nhất.
48
Giữ ngun các thơng sốđiều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH được lựa chọn và lần lượt bổ sung nồng độenzyme α- amylase 0,1 U/g, 0,3 U/g, 0,5 U/g, 1,0 U/g, 1,5 U/g, 2,0 U/g, 2,5 U/g (tính theo khối lượng chất khơ). Hỗn hợp
thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được nồng độ enzyme α- amylase = αi U/g cho khảnăng thủy phân tốt nhất mà vẫn đảm bảo hiệu quả kinh tế.
(v) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân q trình dịch hóa
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ enzyme α- amylase được lựa chọn và lấy mẫu tại các thời 15, 30, 60, 90, 120, 150 phút. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử
DE. Chọn được thời gian dịch hóa= ti (giờ) cho khảnăng thủy phân tốt nhất mà vẫn
đảm bảo hiệu quả kinh tế và phù hợp với giai đoạn đường hóa trong quy trình sản xuất IMO.
(4) Nghiên cứu các thơng số của q trình đường hóa sử dụng enzyme β- amylase và pullulanase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độđến q trình đường hóa
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến q trình đường hóa, tiến hành duy trì phản ứng trong các điều kiện nhiệt độ 45, 50, 55, 60 và 65°C. Các thơng số cịn lại được cố định bao gồm pH 5,0, nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun
sơi trong 10 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác
định đương lượng đường khử DE. Chọn được nhiệt độ = Tii (°C) khi cho mức độ
thủy phân DE cao nhất.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến q trình đường hóa
Giữ ngun các thơng số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và điều chỉnh pH dịch về các giá trị pH 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 bằng axit lactic đặc và NaOH 5N. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE. Chọn được pH= pHii (°C) khi cho mức độ thủy phân DE cao nhất.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độβ-amylase đến q trình đường hóa
Giữ ngun các thơng sốđiều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH
được lựa chọn và bổ sung nồng độβ-amylase lần lượt là 1 U/g, 3 U/g, 5 U/g, 7 U/g, 9 U/g, 11 U/g. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử
DE. Chọn được nồng độβ-amylase là βii (U/g) khi cho DE đạt tối thích. (iv) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độpullulanase đến quá trình đường hóa
Giữ ngun các thơng số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ β-amylase được lựa chọn và bổ sung nồng độ pullulanase lần lượt từ 0 U/g
đến 1,2 U/g. Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử
DE. Chọn được nồng pullulanase là Pii (U/g) khi cho DE đạt tối thích.
(v) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian q trình đường hóa đến sự hình thành IMO
49
Để lựa chọn thời gian q trình đường hóa, tiến hành duy trì điều kiện thủy phân với các thông số đã lựa chọn và lấy mẫu tại các thời điểm khác nhau 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ, 24 giờ. Tiếp đó, sử dụng dịch thu được thực hiện quá trình gắn nhánh để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đường hóa đến hiệu quả quá trình tổng hợp IMO. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10
phút.
Hỗn hợp thu được đem tiến hành xác định đương lượng đường khử DE đồng thời chuẩn bị để thực hiện giai đoạn gắn nhánh. Điều chỉnh pHii dịch sau đường hóa về pH 5,0 (sử dụng axit lactic đặc hoặc NaOH 5M), bổ sung enzyme gắn nhánh transglucosidase nồng độ 15 U/g, phản ứng diễn ra ở 50°C và duy trì trong 12 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách đun sôi trong 10 phút. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var.
diastaticus BE 134. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được thời gian đường hóa= tii (giờ) khi cho
hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
(5) Nghiên cứu các thơng số của q trình gắn nhánh sử dụng enzyme transglucosidase
(i) Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến quá trình gắn nhánh tạo IMO, tiến hành
điều chỉnh pH dịch sau giai đoạn đường hóa về các giá trị pH 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0. Các thơng số cịn lại được cốđịnh bao gồm nhiệt độ 60°C, nồng độ transglucosidase 10 U/g và thời gian phản ứng 12 giờ. Kết thúc phản ứng, diệt enzyme bằng cách
đun sôi trong 10 phút. Lặp lại thí nghiệm 2 lần. Tiếp theo, loại bỏ đường đơn giản trong dịch bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus BE 134. Dịch sau xửlý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được pH= pHiii khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo
được tính kinh tế.
(ii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độđến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Giữ nguyên các thơng sốđiều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi pH
được lựa chọn và nhiệt độ phản ứng lần lượt là 50, 55, 60, 65, 70 °C. Dịch sau xử lý
được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được nhiệt độ = Tiii (°C) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
(iii) Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độenzyme transglucosidase đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nhiệt độ được lựa chọn và bổ sung nồng độ transglucosidase lần lượt là 10 U/g, 15 U/g, 20 U/g, 25 U/g, 30 U/g. Dịch sau xửlý được xác định thành phần IMO bằng hệ
sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được nồng độ transglucosidase là TGiii (U/g) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất.
50
Giữ nguyên các thông số điều kiện thủy phân ở thí nghiệm trên, chỉ thay đổi nồng độ transglucosidase được lựa chọn và tiến hành lấy mẫu ở các thời điểm 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ. Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI. Chọn được thời gian phản ứng thích hợp tiii (giờ) cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.
2.2.2.4. Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp đường hóa – gắn nhánh đồng thời
Hình 2.4: Bố trí thí nghiệm thu hồi IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp đường hóa – gắn nhánh
Tinh bột khoai lang được dịch hóa với các thơng số nồng độ tinh bột, pH, nhiệt
độ, nồng độ enzyme α-amylase đã tối ưu trong phương pháp phân đoạn sản xuất IMO (mục 2.2.5.3) và duy trì trong thời gian 30 phút. Khi kết thúc phản ứng, diệt enzyme ngay bằng cách thêm axit lactic đặc đến pH 3,0. Sử dụng dịch tinh bột đã
dịch hóa để tiến hành khảo sát các thơng số của quy trình đường hóa – gắn nhánh
đồng thời tổng hợp IMO. Các thông số được lựa chọn dựa trên chỉ tiêu hàm lượng IMO234 thu được trong hỗn hợp sản phẩm. Hàm lượng IMO234 (g/l) =IMO2 (g/l) + IMO3 (g/l) + IMO4 (g/l). Thông sốđược lựa chọn cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế.