Nhiệt độ dịch hóa (°C) DE 70 6,21 ± 0,29a 75 9,01 ± 0,14b 80 9,83 ± 0,23c 85 8,36 ± 0,35d 90 7,53 ± 0,16e
Có thể thấy, mức độ thủy phân đạt tối ưu của chế phẩm enzyme Spezyme Xtra tại 80°C. Kết quả này phù hợp với điều kiện nhiệt độ phản ứng tối thích được nhà sản xuất khuyến nghị với chế phẩm Spezyme Xtra (70- 85℃). Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa các DE tạo thành từ các nhiệt độ khác nhau.
Như vậy, lựa chọn nhiệt độ80℃ cho q trình dịch hóa trong nghiên cứu này.
(4) Ảnh hưởng của pH đến q trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành q trình dịch hóa trong điều kiện thay đổi pH dịch hóa trong khoảng
4,5 đến 6,5, cố định nhiệt độ 80°C, nồng độ dịch tinh bột 25%, nồng độ α-amylase
0,5 CU/g cơ chất khô và thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả nhận được về ảnh
hưởng của pH đến q trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra được trình bày trong Bảng 3.17.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của pH đến q trình dịch hóa
pH dịch hóa DE 4,5 6,96 ± 0,16a 5,0 9,81 ± 0,29b 5,5 10,37 ± 0,13b 5,8 11,00 ± 0,26c 6,0 10,32 ± 0,07b 6,5 8,52 ± 0,29d
93
Nhận thấy, trong khoảng khảo sát pH nêu trên, điều kiện pH 4,5 cho kết quả
mức độ thủy phân thấp hơn đáng kể so với các giá trị khảo sát còn lại. Khả năng
hoạt động của enzyme α- amylase tăng dần khi thay đổi pH dịch thủy phân từ 4,5
lên 5,8, sau đó có xu hướng giảm dần khi tiếp tục tăng lên đến pH 6,5. Cụ thể, trong khoảng pH 4,5 đến 5,8, giá trị DE dịch sau thủy phân tăng từ 6,96 lên 11,00. Tiếp tục tăng pH, DE dịch thủy phân thu được giảm xuống lần lượt là 10,32 và 8,52
tương ứng với pH 6,0 và 6,5. Tác động của pH đến khảnăng hoạt động của enzyme dịch hóa được giải thích do q trình ion hóa các nhóm nội phân tử protein, với
enzyme α-amylase sự ion hóa diễn ra ở nhóm liên kết với cơ chất và nhóm xúc tác [155]. Kết quảthu được trong nghiên cứu này gần với điều kiện hoạt động tối thích của chế phẩm Spezyme Xtra (pH 5,5) được báo cáo bởi Shanavas cùng cộng sự
(2011) [252] và hoàn toàn phù hợp với khoảng pH tối ưu 5,0 đến 6,7 được khuyến nghị bởi nhà sản xuất Dupont. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH phản ứng 5,8 cho kết quả cao nhất và có sự khác biệt với các giá trị còn lại.
Như vậy, lựa chọn pH 5,8 cho quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang bằng chế
phẩm Spezyme Xtra.
(5) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến q trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase đến q trình dịch hóa được tiến hành trên dịch tinh bột nồng độ 25%, cốđịnh nhiệt độ 80 °C, pH 5,8, nồng độenzyme thay đổi từ0,3 CU/g đến 2,5 CU/g, duy trì điều kiện thủy phân thời gian 30 phút. Kết quảthu được thể hiện trong Hình 3.14.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến q trình dịch hóa
Sau cùng thời gian phản ứng, khi tăng nồng độenzyme α- amylase từ 0,5 CU/g
đến 2,5 CU/g, mức độ thủy phân thu được có sự chênh lệch đáng kể. Cụ thể, trong khoảng nồng độ0,3 CU/g đến 1,0 CU/g, mức độ thủy phân thay đổi rõ rệt nhất, tăng
từ8,29 đến 15,03. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme phản ứng lên 1,5 CU/g, 2,0 CU/g
và 2,5 CU/g, DE có xu hướng tăng chậm hơn và lần lượt đạt giá trị 16,45, 17,25 và 18,51. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt này có nghĩa giữa các giá trị thu
94
do chính sự tương tác giữa các phân tử enzyme, do đó, khi tăng nồng độ enzyme, khảnăng tiếp xúc giữa phân tửenzyme và cơ chất tăng dẫn đến quá trình thủy phân
được thực hiện nhanh chóng [253]. Tuy nhiên, khảnăng thủy phân cải thiện không
đáng kể sau khi nồng độenzyme đạt 1 CU/g. Nhằm hướng tới mục tiêu nghiên cứu
ứng dụng, việc giảm thiểu chi phí là vấn đề quan trọng. Do đó, nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g là phù hợp nhất cho quá trình dịch hóa của nghiên cứu mà vẫn
đảm bảo tính kinh tế.
Như vậy, lựa chọn nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g với chế phẩm Spezyme Xtra bổ sung vào quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang.
(6) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành nghiên cứu trên dịch tinh bột có nồng độ chất khô 25%, pH 5,8, nhiệt
độ phản ứng 80 °C, nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g chất khô và lấy mẫu sau thời gian phản ứng 15 phút, 30 phút cho tới 150 phút (sau mỗi 30 phút). Kết quả ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến q trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme
Spezyme Xtra được thể hiện qua Hình 3.15.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến q trình dịch hóa
Nhận thấy, thời gian dịch hóa có ảnh hưởng đáng kể đến DE dịch sau thủy phân. Cụ thể, tốc độ phản ứng nhanh được thể hiện rõ trong 60 phút đầu thông qua DE dịch sản phẩm tăng nhanh từ 12,35 đến 18,76. Tiếp tục duy trì điều kiện thủy
phân đến 150 phút, phản ứng có xu hướng thủy phân chậm dần và dịch thủy phân cuối có DE đạt 22,2. Kết quả này có thể được giải thích do tốc độ thủy phân của
enzyme α- amylase trên chuỗi dextrin mạch dài diễn ra nhanh hơn so với chuỗi mạch ngắn. Khi quá trình thủy phân diễn ra, dung dịch hóa lỏng tăng dần số lượng chuỗi mạch ngắn, do đó, q trình thủy phân diễn ra chậm lại. Q trình dịch hóa tinh bột sắn bằng Spezyme Xtra có kết quảtương tự được quan sát bởi Shanavas và cộng sự (2011) [252]. Bên cạnh đó, enzyme α- amylase chỉ có thể thủy phân liên kết
95
đó tốc độ thủy phân dịch tinh bột cịn có thể được tăng lên đáng kể nếu sử dụng enzyme phân cắt liên kết nhánh. Do đó, khống chế thời gian dịch hóa dừng lại sau 60 phút là phù hợp, và đây sẽ là dịch nguyên liệu cho giai đoạn đường hóa tiếp theo
dưới tác dụng của enzyme β- amylase và pullulanase.
Trong một số nghiên cứu đã cơng bố, giai đoạn dịch hóa trong quy trình tổng hợp IMO từ tinh bột được kiểm soát với các mức độ thủy phân khác nhau. Điều kiện dừng hoạt động enzyme α-amylase trong nghiên cứu trên bột chuối của Chockchaisawasdeea và cộng sự (2013) [146] là khi toàn bộ tinh bột đã được thủy phân thành dextrin (không tạo màu xanh lam khi thử với dung dịch KI/ I2), cách tiến
hành tương tự được áp dụng trong nghiên cứu của Basu và cộng sự (2016) [147]. Với tinh bột hạt dẻ, Cui và cộng sự (2017) [154] thực hiện dịch hóa trong thời gian 120 phút, DE dịch đạt 13,8. Trong báo cáo của Niu và cộng sự (2017) [151], dịch tinh bột sau khi xử lí với enzyme α-amylase có DE khoảng 25.
Như vậy, q trình dịch hóa tinh bột khoai lang trong quy trình chuyển hóa tạo
IMO được thực hiện với dịch tinh bột có nồng độ 25% w/v trong điều kiện nhiệt độ
80 °C, pH 5,8, nồng độenzyme α- amylase (chế phẩm Spezyme Xtra) 1,0 CU/g và duy trì phản ứng trong thời gian 60 phút. Sau q trình dịch hóa, DE dịch thủy phân
đạt 18,76. Vô hoạt enzyme α- amylase bằng axit lactic đặc đến pH 3,0 và chuẩn bị cho giai đoạn đường hóa tiếp theo.
3.3.1.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
(1) Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ thay đổi từ45 °C đến 65 °C và cố định pH 5,0, nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn
đường hóa được thể hiện trong Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nhiệt độ đường hóa (°C) DE
45 28,63 ± 1,39a
50 31,75 ± 0,53b
55 31,59 ± 0,61b
60 26,42 ± 0,86c
65 18,13 ± 0,43d
Nhận thấy, khả năng thủy phân tốt nhất của phản ứng đường hóa thu được ở điều kiện nhiệt độ 50°C và 55°C, thể hiện ở giá trịđương lượng đường khử DE cao nhất và khác biệt có nghĩa với các giá trị cịn lại. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ đường hóa từ 45°C đến 55°C, DE của dịch sau đường hóa tăng từ 28,63 đến 31,75. Tiếp
96
tục tăng nhiệt độ đường hóa lên 60°C và 65°C, mức độ thủy phân DE giảm nhanh lần lượt là 26,42 và 18,13. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme β- amylase từ đại mạch và pullulanase lần lượt là 60°C và 55- 60°C (thông tin do nhà sản xuất cung cấp). Tuy nhiên, nhiệt độổn định của chúng tương ứng chỉ dưới 60°C và dưới 50°C, chính vì thế, DE thu được thấp hơn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 60°C. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017) [151] đã chỉ ra hai
enzyme β-amylase (từ đại mạch) và pullulanase (từ Bacillus licheniformis) đều giữ được trên 50% hoạt tính tối đa trong khoảng nhiệt độ 50-60℃. Giai đoạn đường hóa sản xuất IMO trong báo cáo của Saman và cộng sự (2019) [152] cũng lựa chọn nhiệt độ 50°C cho việc sử dụng đồng thời hai enzyme gồm pullulanase và β- amylase cho. Do đó, nhiệt độ 50- 55°C là điều kiện hoạt động tốt nhất cho cả hai enzyme.
Như vậy, lựa chọn điều kiện nhiệt độ 50°C cho giai đoạn đường hóa bằng β- amylase và pullulanase vẫn tạo điều kiện thủy phân tốt, hơn nữa tiết kiệm chi phí
năng lượng so với 55℃.
(2) Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ đường hóa 50°C, pH thay
đổi từ4,5 đến 6,5 và cốđịnh nồng độβ-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của pH đến hoạt
động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa được mơ tả
trong Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong
giai đoạn đường hóa
pH đường hóa DE 4,5 19,74 ± 0,57a 5,0 31,75 ± 0,53bc 5,5 31,76 ± 1,17bc 6,0 32,78 ± 1,01c 6,5 30,98 ± 0,87b
Nhận thấy, khảnăng hoạt động của hai enzyme tương đối ổn định trong khoảng pH 5,0 – 6,0 với đương lượng đường khử dao động từ 31,75 đến 32,78. Ngoài khoảng pH trên, phản ứng cho kết quả DE dịch sau thủy phân thấp hơn là 30,98 và 19,74 tương ứng với pH 6,5 và pH 4,5. Điều kiện pH tối ưu được cung cấp bởi Megazyme của β-amylase và pullulanase lần lượt là 6,0 và 4,5 - 5,5. Do đó, ở pH 4,5 chỉ riêng hoạt động của enzyme pullulanase đạt tối ưu, ngược lại, enzyme β- amylase lại hoạt động không hiệu quả tại pH này dẫn đến DE dịch sau phản ứng thấp hơn đáng kể so với các điều kiện cịn lại. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH 6,0 có giá trị cao nhất và khác biệt với các giá trị cịn lại. Do đó, pH 6,0 là điều kiện tối thích cho sự hoạt động đồng thời của hai enzyme β-amylase và pullulanase
97
pullulanase cùng nguồn gốc được phân tích trong nghiên cứu của Niu và cộng sự
(2017) [151] cũng cho thấy hoạt tính cao nhất khi sử dụng đồng thời cả hai enzyme
thu được trong khoảng pH 5,0 đến 6,0 và đạt trên 50% hoạt tính tối đa của chúng.
Ngồi ra, điều kiện pH 6,0 cũng được Saman và cộng sự (2019) [152] lựa chọn cho
q trình đường hóa sử dụng hai enzyme gồm β-amylase và pullulanase trong quy trình sản xuất IMO.
Như vậy, pH 6,0 được lựa chọn cho giai đoạn đường hóa của q trình tổng hợp IMO từ tinh bột khoai lang.
(3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme β-amylase đến q trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm bằng cách thay đổi nồng độ enzyme β- amylase từ 1
CU/g đến 11 CU/g, điều chỉnh pH = 6,0, cốđịnh nhiệt độđường hóa 50°C, nồng độ
enzyme pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng duy trì trong 3 giờ. Kết quảđược trình bày trong Bảng 3.20.
Bảng 3.20. Ảnh hưởng nồng độ enzyme β-amylase đến q trình đường hóa
Nồng độ enzyme β- amylase DE 1,0 22,12 ± 0,77a 3,0 30,69 ± 0,67b 5,0 32,78 ± 1,01c 7,0 34,00 ± 0,41cd 9,0 34,67 ± 1,02d 11,0 35,15 ± 1,34d
Enzyme β- amylase thủy phân đặc hiệu các liên kết α-1,4 glycosidic từ đầu không khử trong phân tử maltodextrin tạo thành maltose [254], do đó số lượng gốc khử được giải phóng trong dung dịch tăng nhanh, làm DE tăng. Khi tăng nồng độ enzyme β-amylase từ1,0 U/g đến 11 U/g, dịch thủy phân thu được có DE tăng đáng
kể. Trong đó, giá trị DE tăng nhanh từ 22,12 lên 32,78 tương ứng với nồng độ từ 1 U/g lên 5 U/g. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme β-amylase lên 11 U/g, giá trị DE thu
được chỉ tăng thêm 7% (từ 32,78 đến 35,15). Phân tích thống kê cho thấy, trường hợp nồng độ enzyme từ 1 U/g, 3 U/g và 5 U/g cho kết quả DE khác biệt có nghĩa.
DE của dịch ở trường hợp nồng độ enzyme là 5 U/g có khơng có sự khác biệt với 7 U/g, kết quả DE từ 9 U/g, 11 U/g, 7 U/g là tương đồng. Vậy, lựa chọn nồng độ enzyme β- amylase 5 U/g cho giai đoạn đường hóa do nó mang lại hiệu quả hoạt
động cao mà vẫn đảm bảo tính kinh tế.
(4) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến q trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0, nồng độ enzyme β-amylase 5 U/g, thay đổi nồng độ enzyme pullulanase từ 0 đến 1,2 U/g và cố định thời gian đường hóa 3 giờ. Kết quả ảnh
hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa được trình bày trong Bảng 3.21.
98
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ enzyme pullulanase khác nhau được bổ sung vào dung dịch phản ứng đã cho thấy sự tác động đến đương lượng đường khửthu được sau thủy phân. Mẫu đối chứng không bổ sung pullulanase cho mức độ
thủy phân đạt DE 27,45, tuy nhiên giá trị này đã đạt tối đa 34,92 khi bổ sung nồng
độ 1,2 U/g enzyme pullulanase. Từ đó đã cho thấy vai trị của enzyme cắt nhánh
trong giai đoạn đường hóa. Pullulanase có mặt trong dịch thủy phân đã tác động lên các phân tửcơ chất lớn phân nhánh có khảnăng chống lại tác động của β- amylase, sản phẩm tạo thành là các maltodextrin mạch thẳng có độ dài khác nhau, dẫn đến
hàm lượng cơ chất có thể tham gia vào chuyển hóa maltose tăng [151].
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến q trình đường hóa
Nồng độ enzyme pullulanase DE 0 27,45 ± 0,42a 0,2 30,06 ± 0,18b 0,4 31,05 ± 0,96b 0,6 32,78 ± 1,01c 0,8 33,97 ± 0,62d 1,0 34,14 ± 0,41d 1,2 34,92 ± 0,80d
Khi nồng độ enzyme pullulanase bổsung tăng từ 0,2 U/g lên 1,2 U/g, DE dịch thủy phân có xu hướng tăng dần từ 30,06 đến 34,92. Kết quả có xu hướng tăng rõ ràng hơn trong khoảng nồng độ 0,2 U/g đến 0,8 U/g, sau đó tiếp tục tăng nồng độ enzyme đến 1,0 U/g và 1,2 U/g thì kết quả thu được có sự tương đồng. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa nồng độ enzyme 0,8 U/g với các