Enzyme β -amylases chủ yếu được tìm thấy trong thực vật và đã được phân lập từ khoai lang, đậu nành, lúa mạch và lúa mì. Enzyme β-amylase cũng được thu nhận từ một số vi khuẩn như Bacillus polymyxa, B. megaterium, B. cereus và Pseudomonas sp. BQ6. Tất cả các β-amylase này đều tạo sản phẩm thủy phân là maltose và dextrin giới hạn phân tửlượng cao [156].
Các enzyme β – amylase có pH tối ưu nằm trong khoảng 5,0 – 6,0 và nhiệt độ
tối ưu khoảng 50oC. Tuy nhiên, các β – amylase của vi khuẩn thường có tính bền
cao hơn với β – amylase có nguồn gốc thực vật. Chẳng hạn, enzyme β – amylase của lúa mỳ có pHopt = 5,2 – 6,2; Topt = 55 oC. β – amylase của đỗ tương có pHopt =
5,4; Topt = 55 oC, của khoai lang pHopt = 5,0 – 6,0; Topt = 50 oC - 55 oC [155].
Trong sản xuất IMO, enzyme β – amylase có vai trị tiếp tục thủy phân các dextrin mạch dài được tạo thành sau quá trình dịch hóa bằng enzyme α – amylase chịu nhiệt. Mục tiêu của q trình đường hóa nhằm tạo hỗn hợp oligosacharide mạch ngắn như maltose, maltotriose, maltotetraose. Đây là những cơ chất chính cho enzyme transglucosidase hoạt động tạo thành IMO.
34
1.4.3. Enzyme pullulanase
Pullulanase (EC 3.2.1.41) hay còn gọi là α-dextrin 6-glucanohydrolase, pullulan- 6-glucanohydrolase, pullulan- 6- glucanohydrolase và amylopectin 6- glucanohydrolase có nguồn gốc từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau như Bacillus aci-dopullulyticus, Klebsiella planticola, Bacillus deramificans, thermophilic Bacillus sp. AN-7 Bacillus cereus FDTA-13 và Geobacillus stearothermophilus
[163]–[165]. Enzyme pullulanase từ vi sinh vật được quan tâm hơn cả do tác động
đặc hiệu với liên kết α- 1,6 glycosidic trong pullulan- một α- glucan tuyến tính chứa
các đơn vị maltotriose nối nhau bởi liên kết α-1,6 glycosidic.
Dựa trên cơ chất phản ứng, năm nhóm enzyme pullulanase đã được nghiên cứu và báo cáo (Bảng 1.3). Trong đó, pullulanase loại I có khảnăng thủy phân một cách hiệu quả các liên kết α-1,6 glycosidic trong pullulan và polysaccharide phân nhánh,
đã được nghiên cứu rộng rãi [173]. Pullulanase loại II (hay amylopullulanase) có
ứng dụng rộng rãi trong xử lí tinh bột nhờ khả năng thủy phân liên kết α-1,6 glycosidic hoặc α-1,4 glycosidic [176]. Ngoài ra, pullulan hydrolase loại I (neopullulanase) và loại II (isopullulanase) chỉ có thể cắt các liên kết α-1,4 glycosidic trong pullulan, giải phóng panose và isopanose. Khác với các enzyme đã
nêu, pullulan hydrolase loại III có khảnăng tấn cơng pullulan tạo hỗn hợp sản phẩm maltotriose, panose, maltose và glucose. Nó cũng tác dụng trên tinh bột, amylose và amylopectin tạo thành maltotriose và maltose là các sản phẩm chính.
Sự khác biệt chính giữa pullulanase và isoamylase là pullulanase có thể thủy phân liên kết α-1,6 glycosidic của pullulan và amylopectin, trong khi isoamylase chỉ
có thể thủy phân liên kết này trong amylopectin và glycogen [170]. Thêm vào đó, pullulanase có độ bền nhiệt và phạm vi pH tương thích với β-amylase hơn nên mang lại hiệu quảcao hơn khi kết hợp với các enzym đường hóa [171].
Bảng 1.3. Sản phẩm tạo thành của các các nhóm enzyme pullulanase
Enzyme Ký hiệu Tác dụng lên liên kết Cơ chất Sản phẩm cuối Tài liệu tham khảo Pullulanase loại I 3.2.1. 41 α-1,6 glycosidic Oligosaccharide, Polysaccharide và Pullulan Maltotriose [172] , [173] Pullulanase loại II (amylopullulanase) 3.2.1. 41 α-1,6 glycosidic α-1,4 glycosidic Pullulan Oligosaccharide và Polysaccharide (Tinh bột) Maltotriose Hỗn hợp glucose, maltose, maltotriose [174] – [176] Pullulanase hydrolase loại I (neopullulanse) 3.2.1. 135 α-1,4 glycosidic Pullulan Panose [184]
35
1.4.4. Enzyme transglucosidase
Transglucosidase hay α-glucosidase (EC 3.2.1.20, α- D- glucoside glucohydrolase) xúc tác giải phóng glucose từ các đầu khơng khử của α-glucoside, oligosaccharide liên kết α và α-glucans. Enzyme α-glucosidase được chứng minh thể hiện hoạt tính chuyển hóa glycosyl rõ ràng [181], [182].
Transglucosidase ưu tiên xúc tác sự hình thành các liên kết α- 1,6 glycosidic ngồi q trình thủy phân, dẫn đến việc tạo thành các liên kết α-1,6 glycosidic. Cấu trúc isomaltooligosaccharide tạo thành được đặc trưng đồng thời bởi giá trị DP của chúng (từ2 đến ∼10), các kiểu liên kết (α- 1,2; α- 1,3; α- 1,4 và α- 1,6 glycosidic), tỷ lệ và vị trí của từng loại liên kết (chỉ α- 1,6; α-1,4 glycosidic hoặc các liên kết khác kết hợp). Trong đó, tỷ lệ giữa các loại liên kết phụ thuộc vào cơ chất và nguồn gốc của enzyme transglucosidase quyết định việc hình thành các liên kết cụ thể của nó [182], [183]. Các enzyme α-glucosidase khác nhau từđộng vật có vú, cơn trùng, thực vật, nấm và vi khuẩn đã được thu nhận và nghiên cứu như Aspergillus niger
[184], Aspergillus oryzae [148], Aspergillus nidulans [182] và Saccharomyces logos [185]. Chúng có khả năng phản ứng trên nền cơ chất đa dạng [186]. Transglucosidase từ Aspergillus niger chỉ hoạt động tối ưu trên các oligomer của glucose có mức độ trùng hợp thấp (DP) [153].
Theo nghiên cứu của Pazur và French (1952) [148], khi sử dụng cơ chất maltose cho hoạt động của enzyme transglucosidase, các oligosaccharide đều chứa liên kết α-1,6 glycosidic. Kết quả cho thấy enzyme này có khảnăng chuyển các đơn
vị glucose được liên kết bởi α-1,4 glycosidic thành liên kết α-1,6 glycosidic trên cơ
chất thích hợp. Cơ chế phản ứng được tác giả mô tả theo hai bước chính (Hình 1.14). Trong bước đầu tiên, enzyme lấy một đơn vị glucosyl khỏi maltose và tạo thành một phức trung gian enzyme-glucosyl. Trạng thái năng lượng của phức glucosyl-enzyme là sự thay đổi năng lượng tự do cho phản ứng theo hướng tổng hợp liên kết 1,6- glycosidic là âm, trong khi đó năng lượng tựdo thay đổi cho phản
ứng theo hướng tổng hợp liên kết 1,4-glycosidic là dương. Bằng chứng cho giải
thích này được lấy từ các thí nghiệm với glucose phóng xạ và maltose. C14-glucose trong hỗn hợp phản ứng được kết hợp thành isomaltose và dextrantriose nhưng
khơng có trong maltose và panose. Trong bước 2 của phản ứng, phần glucosyl của phức chất trung gian được chuyển sang một saccharide nền. Trong một phản ứng glucose, maltose, maltotriose, isomaltose và panose có chức năng như các cơ chất.
Pullulanase hydrolase loại II (isopullulanse) 3.2.1. 57 α-1,4 glycosidic Pullulan Isopanose [179] Pullulanase hydrolase loại III 3.2.1. -- α-1,6 glycosidic α-1,4 glycosidic Pullulan Tinh bột, amylose, amylopectin Hỗn hợp panose, maltose và maltotriose Maltose và maltotriose [180]
36
Các phản ứng hoàn chỉnh trên maltose được thể hiện trong các phương trình đi kèm. Các đường nằm ngang biểu thị các liên kết 1,4-glycosidic, các đường thẳng đứng biểu thị 1,6-glycosidic và G- là đơn vị glucose. Enzyme dextran-dextrinase như
transglucosidase sẽ chuyển đổi các polymer α-1,4-glucose (dextrin) thành các
polymer α-1,6-glucose (dextran).
Hình 1.14. Cơ chế gắn nhánh của enzyme transglucosidase [148]
1.4.5. Enzyme glucanotransferase
Enzyme glucanotransferase được phân loại thuộc họ glycoside hydrolase (GH) và thuộc nhóm EC 2.4. Nó xúc tác phản ứng chuyển chuỗi α-1,4 glucan đến vị trí mới trong phân tử glucan nhận. Enzyme ứng dụng điển hình trong tổng hợp tinh bột tiêu hóa chậm có thể kể tới enzyme gắn nhánh BE (branching enzyme) và amylomaltase.
Enzyme BE (hay 1,4-α-D-glucan: 1,4-α-D-glucan, 6-α-D-(1,4-α-D-glucano) α- transferase, EC 2.4.1.18, glucosyl hydrolase họ 13 hoặc 70, GH13, GH70) hoạt
động trên liên kết α- 1,4 glycosidic và tạo nhánh liên phân tử hoặc nội phân tử α- glucan thông qua liên kết α- 1,6 glycosidic [187]. Nguồn gốc thu nhận BE đa dạng từ vi sinh vật, thực vật và động vật. BE từ nguồn vi khuẩn khác nhau có sự khác biệt nhỏ trong cơ chế của chúng [188], [189]. BE từ Rhodothermus obamensis có
khảnăng chuyển liên kết α- 1,4 glycosidic của một đoạn chuỗi để tạo các liên kết α- 1,4 glycosidic mới tương tự với amylose, hình thành chuỗi tuyến tính kéo dài [190].
Ngồi ra, đã có báo cáo BE từ Streptococcus mutans chủ yếu chuyển vị các chuỗi α- glucan ngắn với DP từ 6 đến 7 trong suốt quá trình gắn nhánh [191]. Với cùng enzyme BE tiến hành trên bột gạo, các chuỗi nhánh dài hơn DP30 hoàn toàn biến mất và các chuỗi bên mới được tổng hợp vẫn còn sau khi xửlý β- amylase cho thấy vị trí rất gần nhánh của các chuỗi mạch đã được hình thành. Ngồi ra, BE được chứng minh nó cũng xúc tác phản ứng tạo mạch vòng của amylose và amylopectin, sản phẩm tạo thành tương ứng là cycloamylose và cycloamylopectin [192]. Sự hình thành các phân tử có độ phân nhánh cao nhờ enzyme BE đã tạo nên đặc tính tiêu
37
hóa chậm cho tinh bột. Kết quảnày đã được chứng minh thông qua một số nghiên cứu về việc sản xuất α-glucan phân nhánh cao được sử dụng làm thành phần thực phẩm chức năng đểtăng cường đặc tính tiêu hóa chậm [193], [194].
Amylomaltase thuộc họ GH77 và có tên hệ thống 1,4-α-D-glucan: 1,4-α-D- glucan 4-α-D glycosyltransferase. Amylomaltase hoạt động trên cơ chất α-glucan, xúc tác chuyển một đoạn mạch α-1,4 glucan đến vị trí mới của liên kết α-1,4 glycosidic [195]. Tương tự với BE, phản ứng bắt đầu bằng việc thủy phân liên kết
α-1,4 glycosidic trong glucan cơ chất. Sau khi loại đoạn mạch glucan khỏi cơ chất cho, amylomaltase tiếp tục gắn nó vào chuỗi chất nhận thông qua liên kết α-1,4 glycosidic mới [196]. Sự biến đổi tinh bột bởi amylomaltase dẫn đến amylose bị
thủy phân hoàn toàn và chuỗi mạch nhánh amylopectin được kéo dài. Ngoài ra,
amylomaltase cũng thể hiện hoạt động vịng hóa dẫn đến hình thành các cycloamylose có từ8 đến 32 đơn vị glucose [197]. Xét về khảnăng bị phân giải bởi enzyme, các chuỗi nhánh amylopectin kéo dài ít chịu tác động hơn. Thật vậy, tinh bột ngơ biến tính tại điều kiện tối ưu (70°C, pH 7,5) trong 4 giờ bằng amylomaltase nguồn gốc từ Acidothermus cellulolyticus 11B đã làm giảm hàm lượng tinh bột tiêu hóa nhanh từ 80% xuống 60% và tăng hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm từ9% đến 20% [108].
Khi sử dụng trong sản xuất SDS, glucanotransferase thường được kết hợp với enzyme thủy phân bằng cách bổ sung riêng lẻ hoặc kết hợp sử dụng đồng thời [198].
1.5. Tính cấp thiết và nội dung nghiên cứu
Gần đây, trong một nghiên cứu về phong cách sống kinh tế xã hội dựa trên bảng câu hỏi về tần suất thực phẩm sử dụng của các đối tượng từ 35–70 tuổi ở 18 quốc gia đã chỉ ra việc tiêu thụ lượng lớn carbohydrate có sẵn trong thực phẩm có thể liên quan đến nguy cơ tửvong cao hơn [199]. Ngày nay, nhận thức và hành vi
người tiêu dùng khi sử dụng thực phẩm cũng đang dần thay đổi và chuyển hướng sang sử dụng nhiều hơn các thực phẩm dinh dưỡng có khảnăng ngăn ngừa bệnh tật và cải thiện sức khỏe. Điều này thể hiện qua doanh số bán thực phẩm có chức năng tăng cường sức khỏe tăng, đặc biệt là các sản phẩm chứa hàm lượng carbohydrate thấp, chất xơ cao, chất béo thấp, cholesterol thấp và natri thấp [9]. Nghiên cứu thị trường dự báo nhu cầu này sẽngày càng tăng lên, cụ thể, thịtrường prebiotics tồn cầu sẽđạt 7,11 tỷ đơ la vào năm 2024 (số liệu năm 2016) và nhu cầu về thực phẩm chức năng sinh học có hàm lượng đường huyết thấp bao gồm doanh thu thị trường tinh bột tiêu hóa chậm dự kiến đạt khoảng 12 tỷđơ la vào năm 2025 [8]. Các nghiên cứu về quy trình sản xuất và cơng bố về lợi ích sức khỏe của các thành phần chức
năng này cũng đang nhận được sự quan tâm mạnh mẽ bởi giới khoa học. Theo dữ
liệu tài nguyên phân tích bằng sáng chế toàn cầu của Patent Lens, trong giai đoạn 2013-2017, các bằng sáng chế liên quan đến IMO đã tăng 4,3% trong khi dữ liệu FOS (fructooligosaccharides) tăng 4,2% và GOS (galactooligosaccharide) tăng
2,1%. Số liệu này cho thấy tầm quan trọng của các thành phần chức năng và thị trường ứng dụng của chúng đang ngày càng được mở rộng, đi đến gần hơn với
38
Có thể thấy, IMO và SDS là hai thành phần chức năng mang lại các lợi ích quý báu cho sức khỏe, phù hợp với định hướng phát triển của thị trường và đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng trong xã hội hiện đại. Thêm vào đó, nguồn ngun liệu
chính được sử dụng để sản xuất IMO và SDS trong công nghiệp là tinh bột tự nhiên,
đây cũng là một nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có và đang được chú trọng nghiên cứu để tăng cường giá trị thương mại tại Việt Nam. Do đó, việc phát triển quy trình sản xuất IMO và SDS từ tinh bột là đề tài mang tính cấp thiết hướng tới mục tiêu làm chủ quy trình sản xuất trong quy mơ công nghiệp. Tuy nhiên, các nghiên cứu trong nước hiện nay mới chỉ dừng lại ở việc nghiên cứu và khảo sát trên nhiều đối
tượng mà chưa đi đến việc phát triển các sản phẩm sau khi đã biến tính làm gia tăng
SDS, RS. Bên cạnh đó, các phương pháp biến tính của các nhóm tác giả chưa có
hiệu quả cao trong việc nâng cao hàm lượng SDS. Chính vì vậy, việc ứng dụng SDS trong sản xuất thực phẩm còn nhiều hạn chế và chưa đưa vào các sản phẩm một cách hiệu quả. Thành phần IMO cũng chưa nhận được sự chú ý của các học giả, do
đó, chưa có nghiên cứu nào về hồn thiện quy trình sản xuất IMO từ tinh bột theo
phương pháp enzyme tại Việt Nam.
Khoai lang được biết đến là cây lương thực có sản lượng hàng năm lớn và tinh bột khoai lang là nguồn nguyên liệu dồi dào nhưng chưa có nhiều ứng dụng đem lại giá trị cao. Các nghiên cứu tại Việt Nam hướng đến tạo thành phần chức năng trên
tinh bột khoai lang cũng chưa được chú trọng. Như vậy, đây là nguồn nguyên liệu mới và có tiềm năng lớn để khai thác sản xuất các thành phần thực phẩm chức năng.
Từ những dữ kiện và phân tích trên, tác giả đi đến quyết định thực hiện đề tài
“Nghiên cứu quá trình thuỷ phân tinh bột khoai lang bằng phương pháp enzyme tạo tinh bột tiêu hoá chậm và isomaltooligosaccharide nhằm ứng dụng trong thực phẩm” với các nội dung:
Nội dung 1: Nghiên cứu đặc tính tinh bột khoai lang và khả năng thu hồi tinh bột của các giống khoai Việt Nam
Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện thu nhận tinh bột tiêu hóa chậm và đặc tính của tinh bột tiêu hóa chậm thành phẩm
2.1. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thủy phân thích hợp tinh bột khoai lang bằng
enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS
2.2. Nghiên cứu chếđộ thối hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng SDS
2.3. Đánh giá chất lượng sản phẩm và đưa ra quy trình sản xuất tinh bột tiêu hóa chậm từ tinh bột khoai lang
Nội dung 3: Nghiên cứu điều kiện thu nhận isomaltooligosccharide và đặc tính của isomaltooligosccharide thành phẩm
3.1. Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp phân đoạn
3.2. Xác định điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp đường hóa và gắn nhánh đồng thời
39
Nội dung 4: Khảo sát khả năng ứng dụng tinh bột tiêu hóa chậm và isomaltooligosccharide trong sản xuất thực phẩm
4.1. Ứng dụng bổ sung tinh bột tiêu hóa chậm vào sản phẩm miến dong 4.2. Ứng dụng bổ sung IMO vào sản phẩm sữa tươi và nước quả
40
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu tinh bột khoai lang
Khoai lang củtươi được thu mua tại điểm canh tác trong ngày thu hoạch, sau
đó tiến hành tách và thu nhận tinh bột cùng ngày tại phịng thí nghiệm C4-209, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội. Các giống khoai lang nguyên liệu được thu mua vào vụ Đông Xuân. Nguồn gốc, đặc
điểm nhận biết và điều kiện canh tác của sáu mẫu được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Đặc điểm của sáu giống khoai lang nguyên liệu
Giống khoai lang Kí hiệu Địa điểm canh tác Màu vỏ Màu ruột Điều kiện canh tác Nhiệt độ (oC) và lượng mưa (mm) trung bình năm* Đất trồng
1 Long cũHoàng HLC BViắc Giang ệt Yên, Vàng
Vàng nhạt 23,6oC 1545,9 mm Bạc màu 2 Hoàng Long mới HLM Yên Dũng, Bắc Giang Vàng nhạt Vàng nhạt 23,6oC 1545,9 mm Bạc màu 3 Nhật Gia Lai NGL Phú Thiện, Gia Lai Tím Vàng 21,9oC 2179,9 mm Đất nâu thẫm trên nền phù sa cổ 4 Nhật Đà Lạt NDL Đà Lạt, Lâm Đồng Tím Vàng 18,0oC 1814,9 mm Phù sa 5 Nhật ruột trắng NRT Nam Trực, Nam Định Tím đậm Trắng 23,7 oC 1701,4 mm Cát pha 6 Nhật ruột vàng NRV Nam Trực, Nam Định Tím đậm Vàng 23,7oC 1701,4 mm Cát pha
* Số liệu lấy từ QCVN 02:2021/BXD: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia số liệu điều kiện tự nhiên trong xây dựng
2.1.2. Chế phẩm enzyme