Theo thương phâp năy người ta đânh giâ hoạt độ amylaza theo khả năng thuỷ phđn tinh bột của enzyme chứa trong 1 gam chế phẩm đến sản phẩm không mău với iốt vă biểu diễn bằng đơn vị.
Đơn vị hoạt động của amylaza có khả năng phđn giải 1gam tinh bột tạo thănh sản phẩm không có mău với iốt trong thời gian 1 giờ vă ở điều kiện nhiệt độ 30oC, pH = 4,7 – 4,8
10.1.1. Hoâ chất cần dùng
Dung dịch đệm axítat natri :
Dung dịch axit axític 1N: Lấy 57,25 ml hoặc 60,12 gam axit axític tinh khiết rồi pha thănh 1 lít
Dung dịch axítat natri 1N: Cđn đúng 82,09 gam axítat natri rồi hoă tan thănh một lít dung dịch.
Muốn có dung dịch đệm pH = 4,7 – 4,8 , ta pha lẫn hai dung dịch kể trín theo tỉ lệ 1:1
Muốn có dung dịch đệm pH = 6 ta lấy thể tích axit axític pha với 16 thể tích dung dịch axítat natri.
10.1.2. Dung dịch tinh bột 1%
Cđn 1,1 gam tinh bột văo cốc, sau đó cho 25ml nước lạnh vă lắc đều rồi cộng thím 30ml nước nóng 50oC,khuấy đều rồi đặt văo đun câch thuỷ cho đến khi hoă tan hoăn toăn. Để nguội rồi chuyển toăn bộ văo bình định mức 100ml dung dịch đệm axítat có pH = 4,7-4,8 ,rồi thím nước cất tới vạch định mức.
10.1.3. Dung dịch iốt
Cđn 4,4 gam KI văo 1,4 I2 tinh thể. Sau đó cho tất cả văo cốc vă cộng thím 20- 40 ml nước cất khuấy cho đến khi tan hoăn toăn rồi chuyển toăn bộ văo bình định mức 100ml vă thím nước cất văo cho đủ. Dung dịch năy được gọi lă dung dịch iốt cơ bản, cần được bảo quản trong bình mău nđu vă đặt trong chổ tối. Dung dịch có thể bảo quản vă dung trong vòng 3 thâng.
Dung dịch iốt phđn tích được chuẩn bị từ dung dịch cơ bản trước khi đem dung. Lấy 20ml dung dịch iốt cơ bản cho văo cốc đê chứa sẵn 4,4 gam KI, hoă tan hết rồi chuyển toăn bộ văo bình định mức 100ml thím nước cất cho đủ.Dung dịch có thể sử dụng trong vòng 15 ngăy.
10.1.4. Câch tiến hănh
Để xâc định hoạt độ trước hết ta phải chuẩn bị dung dịch enzyme. Dung dịch enzyme chuẩn bị như sau:
Cđn 5 gam chế phẩm nấm mốc rồi đem nghiền nhỏ với cât hoặc bột thuỷ tinh. Tiếp theo hoă tan với 10ml Dung dịch đệm vă 90 ml nước cất. Chuyển toăn bộ văo cốc hoặc bình tam giâc vă giữ nhiệt độ 30oC trong 30 phút. Tiếp theo đem lọc qua giấy, nước trong thu văo cốc khô vă dung để xâc định hoạt độ amylaza.
Để tiến hănh thuỷ phđn ta dung pipĩt lấy 25ml dung dịch tinh bột cho văo bình tao giâc 100ml, sau đó cộng thím 20ml nước cất rồi 5ml dung dịch amylaza. Lắc đều vă giữ nhiệt độ 30oC. Sau 10 phút, ta thử mău với iốt bằng câch lấy 1 giọt dung dịch thuỷ phđn cho văo tấm sứ trắng rồi nhỏ dung dịch iốt văo. Ta liín tục thử như vậy cho đến khi dung dịch thuỷ phđn không lăm đổi mău iốt. Đânh dấu thời gian từ khi cho dung dịch amylaza văo cho đến khi thuỷ phđn đến sản phẩm cuối cùng không có mău với iốt. Thời gian năy phải trong khoảng 10 – 20 phút. Nếu nằm ngoăi giới hạn trín thì cần phải thay đổi số ml dịch enzyme cho phù hợp vă lăm lại thi nghiệm, chú ý lượng nước cất cộng với amylaza phải luôn bằng 25, còn thể tích dịch thuỷ phđn phải bằng 50ml
10.1.5. Tính hoạt độ amylaza theo công thức sau
T a T a Had × = × ×60 15 25 , 0
0,25 - Lượng tinh bột chứa trong 25ml dung dịch tính theo gam
a - Lượng chế phẩm nấm mốc tương đương với số ml dịch amylaza đưa văo thuỷ phđn tính theo gam
t - Thời gian thuỷ phđn – phút 60 - Hệ số chuyển giờ thănh phút