BÀI 1 : NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH THỦY SẢN
3. Bệnh virus trên tôm
3.5. Phương pháp chẩn đoán bệnh
a. Những phương pháp cơ bản trong phịng thí nghiệm
Có thể sử dụng một số phương pháp cơ bản trong phịng thí nghiệm để giúp đánh giá được tình trạng sức khỏe của tơm ni và có thể nhận định nguyên
nhân bùng phát bệnh trong thời gian tới. Các phương pháp này có thể thực hiện trực tiếp ở trại ni:
- Phương pháp kính phết huyết tương: đây là phương pháp huyết học để quan sát hình thái của hồng cầu, vi khuẩn và ký sinh trùng trong máu. Những thay đổi hình dạng bất thường của nhân có thể do tác nhân vi khuẩn Vibrio hoặc sự xuất hiện của thể lạ (thể ẩn, thể vùi) trong nhân có thể liên quan đến bệnh đàu vàng (YHD) hay bệnh tơm cịi (MBV). Trong một số trường hợp bệnh tác nhân là virus nhưng vẫn không xuất hiện các thể lạ.
- Phương pháp quan sát tiêu bản tươi: Lấy mẫu mang hay các phụ bộ của tơm để lên lam kính, cho giọt nước muối NaCl 2,8% hoặc nước cất và đậy lại quan sát dưới kính hiển vi có thể phát hiện được các vi khuẩn dạng sợi, vi khuẩn Vibrio hình que, nấm, nguyên sinh động vật, tảo hay bùn bả hữu cơ.
- Phương pháp cố định mẫu bằng dung dịch Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm Heamatoxyline và Eosin (H&E) có thể phát hiện virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHV), virus gây hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan lập biểu mô (IHHNV), các vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm Mycosis.
b. Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn
Các vi khuẩn cần phải nuôi cấy và phân lập trên môi trường chuyên biệt. Bệnh vi khuẩn trên tôm biển thường do vi khuẩn Vibro, môi trường nuôi cấy đặc trưng cho vi khuẩn này là TCBS. Vi khuẩn phát quang được nuôi cấy trên môi trường phát quang. Sử dụng phương pháp phản ứng sinh hóa truyền thống có thể phân lập được vi khuẩn đến mức lồi. Tuy nhiên hiện nay có thể định danh vi khuẩn bằng các phương pháp PCR, lai phân tử được sử dụng phổ biến các phịng thí nghiệm hiện đại.
c. Phương pháp mô học
Phương pháp mô học nghiên cứu mức độ hiển vi của cấu trúc các tế bào. Sự khác biệt về cấu trúc của tế bào mẫu mơ bệnh học so với tế bào bình thường cho biết mức độ và tác nhân gây bệnh. Phương pháp này trải qua nhiều công đoạn cho nên mất khá nhiều thời gian do đó rất khó khăn đưa ra khuyến cáo ngay trong nhiều trường hợp tơm bệnh cấp tính.
Mẫu tơm bệnh thường bị phân hủy rất nhanh nên sau khi thu mẫu cần phải cố định ngay bằng Davidson, sau đó là đúc khối sáp cắt thành từng lát rất mỏng, để vào nước ấm sau đó để lên lam và nhuộm màu. Với kỹ thuật nhuộm đặc trưng, các thành phần của tế bào sẽ bắt màu khác nhau và quan sát dưới kính hiển vi. Thông thường các công đoạn của phương pháp này thường được tiến
hành trong các phịng thí nghiệp lớn với điều kiện nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ phòng.
d. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
Dựa vào đặc tính tổng hợp AND nhờ men polymerase cần đoạn mồi chuyên biệt để tổng hợp AND mới từ mạch khuôn ban đầu. Đây là phương pháp khuếch đại đoạn ADN nhờ mồi chuyên biệt của mầm bệnh lên nhiều lần cho phép phát hiện giai đoạn sớm của bệnh. Phương pháp này có thể đồng thời phát hiện một hay nhiều tác nhân gây bệnh nhất là bệnh do vi khuẩn và virus.
3.6. Đặc điểm chung của bệnh virus trên tôm
Bệnh virus ở giáp xác được ghi nhận từ những năm 1960, đến nay có hơn 30 bệnh virus được phát hiện. Bệnh virus xuất hiện nhiều và gây bệnh nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm ở Châu Á là bệnh đầu vàng và bệnh đốm trắng. Năm 1986, bệnh đầu vàng đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm ở Đài Loan, Indonesia, Malaisia và Philipines. Năm 1990, bệnh đầu vàng xuất hiện ở Thái Lan và bộc phát mạnh vào năm 1995 gây tổn thất cho nghề nuôi tôm gần 40 triệu USD. Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên ở Trung Quốc và Nhật Bản năm 1992, 1993. Cho đến nay bệnh này được xem là bệnh nguy hiểm nhất, gây hậu quả nghiêm trọng cho nghề ni tơm ở Châu Á.
Mỗi lồi virus thường gây bệnh cho ít nhất một lồi, thường là vài lồi tơm ni, và mức độ nhiễm bệnh cũng khác nhau tuỳ lồi vật chủ. Mầm bệnh virus có thể tồn tại dưới dạng thể ẩn trong tất cả các giai đoạn phát triển của vật chủ tuy nhiên chúng chỉ gây bệnh và gây chết vật chủ ở điều kiện thuận lợi. Mầm bệnh virus có thể lây lan từ lồi này sang một vài lồi khác và có liên quan trực tiếp đến các điều kiện gây sốc như mật độ cao, sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ, pH, độ mặn. Nhập và vận chuyển giống từ nơi này đến nơi khác cũng là một nguyên nhân lây truyền bệnh. Hiện nay chưa có cách trị bệnh virus hiệu quả nên việc áp dụng các biện pháp phịng bệnh như chọn tơm giống sạch bệnh, xử lý nước cấp và nước thải trong q trình ni và quản lý tốt mơi trường nuôi là rất cần thiết. Trong thời đại ngày nay việc gia hóa tìm ra các giống loài thuần khiết, sạch bệnh và quen với điều kiện nuôi công nghiệp đang được ưu tiên nghiên cứu ở một số nước và đã áp dụng vào sản xuất.
a. Bệnh MBV
Hình 4.29: Bệnh cịi trên tơm sú
- Tác nhân gây bệnh
Bệnh MBV hay cịn gọi là bệnh tơm cịi, do virus Monodon Baculovirus. Đây là virus có dạng hình que, kích thước nhân dao động từ 75-300 nm, acid nucleic là AND, nhân có màng bao. MBV ký sinh ở tế bào biểu mơ hình ống của gan tuỵ và trước ruột giữa (Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005). Tôm bị bệnh nặng, nhân tế bào trương to gấp hai lần bình thường. Trong nhân chứa một đến nhiều thể ẩn, trong thể ẩn chứa nhiều virus. Virus phá vỡ tế bào ký chủ và lây lan sang các tế khác hay phóng thích ra bên ngồi mơi trường, tồn tại tự do trong bùn và nước (Bùi Quang Tề, 2003).
- Phân bố
Phát hiện đầu tiên năm 1980 từ đàn tôm sú (Penaeus monodon) đưa từ Đài Loan sang ni ở Mexico, sau đó lan truyền rộng khắp trên các châu lục.
Khu vực châu Á-Thái Bình Dương: Thái Lan, Đài loan, Philippines, Malaisia, Indonesia, Trung Quốc, Singapore, Triều Tiên, Úc, Ấn Độ, Srilanka và Việt Nam.
Khu vực Trung Đông: Kuwait, Oman, Israen… Châu Phi: Gambia, Kenya....
Châu Mỹ: Hawaii, Mexico, Ecuador, Brazil...
- Lồi cảm nhiễm
MBV có thể nhiễm ở nhiều tơm he khác nhau: P. monodon, P. stylyrostris,
P. vanamei, P. setiferus, P.semisulcatus, P. penicillatus, P. esculentus. Trong đó,
Bệnh MBV phát triển hầu hết các giai đoạn của tôm, bắt đầu từ giai đoạn Zoea 2 trở đi, gây thiệt hại nghiêm trọng nhất giai đoạn Postlarve 25 và ít thiệt hại ở giai đoạn tôm thịt.
Ở Việt Nam, bệnh MBV trên tôm sú (Penaeus monodon) được Bùi Quang Tề nghiên cứu từ năm 1991 ở các tỉnh phía Nam với tỷ lệ nhiễm khá cao ở tôm thịt từ 50-92%, tơm giống từ 5-100%. Tiếp sau đó nghiên cứu Đỗ Thị Hòa và ctv từ 1994-1995 tiếp tục khẳng định tỷ lệ cảm nhiễm MBV trên tôm sú khá cao trên tất cả các giai đoạn nuôi: ấu trùng 33,8%, tôm giống 52,5% và tôm thịt 66,5%. Kết quả nghiên cứu gần đây của Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương năm 2005 cho thấy tỉ lệ nhiễm MBV ở tơm sú giống trên cả nước vẫn cịn khá cao 46,4%. Tác động bệnh MBV trên tôm sú nuôi thương phẩm ngày càng lớn trong vài năm trở lại đây (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
MBV có khả năng chịu đựng cao với thuốc sát trùng: Iodine 15ppm, chlorine 10 ppm virus vẫn tồn tại từ 6-8 giờ, có thể sống ở độ mặn 0%o, nhiệt độ 370C nhưng lại nhạy cảm với ánh sáng mặt trời. MBV sẽ mất tính cảm nhiễm sau 6-8 giờ dưới ánh sáng mặt trời ở cường độ trung bình.
Bệnh MBV lan truyền cả trục ngang và dọc (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004).
- Dấu hiệu bệnh lý
Tơm nhiễm MBV nhẹ khơng có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng. Bệnh nặng cơ thể tơm có màu xanh sẩm, lờ đờ, mang có màu đen, sinh trưởng chậm chu kỳ lột xác kéo dài và chuyển sang khơng đều. Gan tụy teo lại và có màu vàng, tơm giảm ăn, ruột khơng đầy có khi rổng, mang và vỏ có nhiều sinh vật bám. Tơm chết dần từ 3-7 ngày, tỉ lệ chết có thể 70-100%.
Nếu trong mơi trường có nhiều tảo đáy và vi khuẩn thì dễ làm cho tơm bị đóng rong.
Bệnh MBV xảy ra quanh năm, và tỉ lệ mang mầm bệnh trên đàn tôm giống rất cao, nhất là ương trong ao đất khơng có điều kiện cải tạo triệt để giữa các lần ương.
- Chẩn đoán
+ Dựa vào dấu hiệu bệnh lý.
+ Quan sát thể ẩn MBV dưới kính hiển vi quang học bằng cách nhuộm tiêu bản tươi của những bộ phận như gan tuỵ, ruột giữa và phân tôm bằng dung dịch Malachite green 0,1%. Các thể ẩn MBV bắt màu xanh của phẩm nhuộm có hình cầu nằm riêng lẽ hay dính thành chùm.
+ Nhuộm bằng Hematoxilin và Eosin. Các thể ẩn sẽ có màu đỏ thẩm đồng đều, nhân tế bào màu xanh tím, tế bào chất có màu hồng hoặc đỏ.
+ Kỹ thuật PCR và RT - PCR.
- Phịng bệnh
Đối với sản xuất tơm giống:
+ Kiểm định đàn tôm bố mẹ trước khi cho đẻ dùng tơm bố mẹ khơng hoặc bị nhiễm bệnh MBV ít để sinh sản bằng cách kiểm tra phân tôm. Không nên nhốt chung tôm bố mẹ từ các nguồn khác nhau.
+ Rửa trứng, ấu trùng bằng các hoá chất sát trùng: formol, iodine. + Nguồn nước và dụng cụ phải được tiệt trùng trước khi sử dụng. + Không dùng chung dụng cụ giữa các bể ấp khác nhau.
+ Không nên ương với mật độ quá dày. + Loại bỏ tôm giống nếu bị nhiễm nặng. + Khống chế mật độ ương phù hợp. Đối với nuôi thịt:
- Chọn đàn giống khơng hoặc ít nhiễm MBV, kích cỡ nhỏ, sẵm màu. - Loại bỏ những con yếu, mang mầm bệnh bằng cách gây sốc formaline. - Tẩy dọn cẩn thận ao nuôi, khử trùng nước và không bỏ qua khâu phơi nắng đáy ao.
- Nuôi tôm theo đúng mùa vụ, quản ý chăm sóc tốt, cung cấp đầy đủ thức ăn về chất và lượng, hạn chế điều kiện môi trường gây sốc cho tôm.
- Khơng nên ni mật độ cao.
Hình 2.2: Tơm sú bệnh đầu vàng (trái), tôm khỏe (phải)
(Nguồn: Bùi Quang Tề, 2003)
- Tác nhân gây bệnh
Bệnh đầu vàng ở tôm he do virus là Rhabdovirus thuộc họ Rhabdoviridae, nhưng những nghiên cứu gần đây ở Úc thì tác nhân gây bệnh đầu vàng lại thuộc họ Coronaviridae. Virus có hình que ngắn, chúng xâm nhập và phát triển trong tế bào chất trong tế bào của các cơ quan: máu, mang, gan tuỵ …
- Phân bố
Bệnh đầu vàng phân bố rộng, có liên quan đến các quốc gia có ni tơm sú: Thái Lan, Đài loan, Philippines, Malaisia, Indonesia, Trung Quốc. Ở Việt Nam cũng có ghi nhận một số trường hợp tơm chết có dấu hiệu bệnh lý giống như bệnh đầu vàng nhưng chưa có nghiên cứu nào được cơng bố.
- Lồi nhiễm bệnh
Virus cảm nhiễm trên một số lồi tơm như: P. monodon, P. stylyrostris, P. vanamei, P. setiferus, P. duorarum. Tuy nhiên, từ cảm nhiễm nhân tạo người ta đã phát hiện được nhiều lồi tơm he đề kháng với bệnh đầu vàng: P. merguiensis, Metapeneus ensis.
Giai đoạn cảm nhiễm: xảy ra hầu hết ở các giai đoạn, chủ yếu là là giai đoạn tôm giống, nhất là giai đoạn tơm sú ni từ 50-70 ngày tuổi. Bệnh có thể lây nhiễm theo hai phương thức: dọc và ngang và thường xuất hiện trong ao nuôi thâm canh.
- Dấu hiệu bệnh lý
Trước khi bệnh tôm ăn nhiều một cách lạ thường trong 1-2 ngày, ngày thứ ba tôm ngừng ăn và lờ đờ trên mặt nước, sau đó tơm bắt đầu chết với mức độ tăng dần.Tơm có thể chết nghiêm trọng đến 100% sau 3-5 ngày. Mang có màu trắng hay nâu, gan tụy có màu vàng và sưng, tồn thân có màu nhợt nhạt.
- Chẩn đoán
+ Dựa vào dấu hiệu bệnh lý đặc trưng
+ Nhuộm mẫu máu quan sát dưới kính hiển vi + Phương pháp mô bệnh học
+ Nhuộm Giemsa hoặc Hematoxylin và Eosin + Kỹ thuật PCR
- Phòng bệnh
Áp dụng biện pháp phòng bệnh tổng hợp đối với bệnh virus: + Tránh vận chuyển tơm từ nơi có bệnh đến nơi chưa có bệnh. + Vớt tơm chết ra khỏi ao, xử lý tôm chết trong vôi nung hay đốt. + Tẩy trùng nước khi có tơm bị bệnh trước khi thải ra mơi trường.
+ Phịng bệnh bằng cách chọn tơm giống có chất lượng tốt, thả tôm đúng thời vụ.
+ Thường xuyên theo dõi tình trạng tơm, thu hoạch nhanh nếu phát hiện bệnh.
trường.
+ Nếu tôm nhỏ không đáng thu phải xử lý kỹ trước khi thải ra môi + Tăng cường sức đề kháng của tôm.
+ Quản lý tốt thức ăn và môi trường nuôi.
c. Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus - WSSV)
Hình 4.30: Đốm trắng nằm trong giáp đầu ngực tơm sú
(Nguồn: Đỗ Thị Hịa và ctv, 2002)
- Tác nhân gây bệnh
+ Virus hình trứng, nhân có màng bao, acid nucleic là AND thuộc giống Whispovirus, họ Nemaviridae. Đây là tác nhân gây bệnh có độc lực cao và có khả năng lây nhiễm thành dịch bệnh.
+ Khi tôm bệnh đốm trắng xuất hiện nhiều thể vùi. Virus ký sinh trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, tế bào biểu bì dưới vỏ, cơ quan lympho gây hoại tử và nhân sưng to.
+ Khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện.
Phân bố rất rộng: Thái Lan, Đài loan, Philippines, Indonesia, Úc, Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Việt Nam.
Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng xuất hiện năm 1993 + 1994 ở các tỉnh ven biển phía Nam. Đến năm 1996 + 1997, xuất hiện ở các tỉnh ven biển miền Trung và miền Bắc.
Bệnh thường xảy ra ở tôm giống đến tôm trưởng thành. Khi môi trường nuôi tôm xấu bệnh dễ xuất hiện.
Mùa xuất hiện bệnh: nhất là mùa đông, mùa xuân và đầu hè khi thời tiết biến đổi nhiều như biên độ nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn gây sốc cho tôm. Tôm sú sau nuôi 1-2 tháng bệnh đốm trắng xuất hiện và gây tôm chết hàng loạt.
- Loài cảm nhiễm
Cảm nhiễm trên nhiều lồi tơm khác nhau: P. monodon, P. japonicus, P.
chinensis, P. indicus, P. vanamei, P. setiferus…. Ngồi tơm he, tơm hùm, tôm đất,
tôm càng, cua, artemia, copepode cũng cảm nhiễm loại virus này trong tự nhiên hay nhân tạo.
- Dấu hiệu bệnh lý
Trên thân có nhiều đốm trắng đường kính 0,5-3mm bên trong vỏ, nhất là ở giáp đầu ngực và đốt bụng 5-6 sau đó lan ra khắp cơ thể. Tơm bị nhiễm bệnh bơi lờ đờ, nổi lên mặt hay dạt vào bờ. Tất cả những tơm vào bờ đều có ruột rổng (Đỗ Thị Hịa và ctv, 2002). Phụ bộ bị gãy hoặc mất, tôm giảm ăn. Khi bệnh nặng, cấu trúc tế bào thay đổi, nhân tế bào phình to và chứa nhiều thể vùi. Tơm bệnh cơ thể chuyển sang màu hồng đỏ, hiện tượng tơm chất xảy ra sau đó, tơm có thể chết từ 90-100% trong vịng 3-7 ngày (Đặng Thị Hồng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa, 2005) .
- Chẩn đoán
Dựa vào dấu hiệu bệnh lý đặc trưng.
Nhuộm vết bôi mô mang tôm bệnh bằng Giemsa và Wright hay nhuộm mang tôm bệnh bằng Hematoxylin và Eosin.
Sử dụng bộ Testkit chẩn đốn nhanh WSSV. Phương pháp mơ học.
Kỹ thuật PCR.
- Phịng bệnh
Xét nghiệm tơm giống bằng kỹ thuật PCR để nuôi tôm thịt.
Áp dụng kỹ thuật gây sốc Postlavae bằng formol với 150-200 có sục khí mạnh trong vịng 30 phút.
Chuẩn bị ao kỹ đúng quy trình trước khi ni, diệt các lồi giáp xác nhỏ mang mầm bệnh và các lồi chim cị ăn tôm cá. Dùng formol hoặc chlorine diệt virus tự do trong môi trường nước.
Quản lý tốt chất lượng, số lượng thức ăn, kỹ thuật cho ăn.