2.6.1. Thử hoạt tính ức chế sản sinh NO in vitro của các hợp chất phân lập đƣợc
Dòng tế bào đại thực bào RAW 264,7 đƣợc lấy từ Viện Sinh học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Modified Eagle Medium của Dulbecco (DMEM, Gibco Co., NY, USA) chứa 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, 1 mM sodium pyruvate và đƣợc bổ sung với 10% etal bovine serum (FBS), ủ ở 370C trong khơng khí ẩm 5% CO2.
Tế bào RAW 264.7 ở môi trƣờng DMEM trong đĩa 96 giếng đƣợc ủ trong 24 giờ và sản sinh NO đƣợc kích thích bởi LPS (1 μg/mL). Thuốc thử Griess 100 μL (50 μL 1% (w/v) sulfanilamide trong acid photphoric 5% (v/v) và 50 μL 0,1% (w/v) N-1- naphthylethylenediamine dihydrochloride) đƣợc thêm vào, sau đó ủ trong phịng nhiệt độ khoảng 10 phút. Nitrite (NO2-) đƣợc xem là chỉ thị cho việc tạo NO, sẽ đƣợc xác định nhờ bộ Griess Reagent System (Promega Cooperation, WI, USA). Đầu đọc vi tấm đƣợc sử dụng để đánh giá độ hấp thụ ở bƣớc sóng 540 nm. NG-Methyl-L-arginine acetate (L-NMMA) (Sigma) đƣợc sử dụng nhƣ một đối chứng dƣơng ở 100; 20; 4 và 0,8 g / mL. Hàm lƣợng nitrite của từng mẫu thí nghiệm đƣợc xác định nhờ vào đƣờng cong hàm lƣợng chuẩn NaNO2 và đƣợc so sánh % với mẫu chứng âm (LPS). Khả năng ức chế sản sinh NO của mẫu đƣợc xác định nhờ công thức :
% ức chế =100%- [hàm lƣợng NOsample/hàm lƣợng NOLPS]*100
Giá trị IC50 đƣợc tính tốn từ phân tích hồi quy phi tuyến tính dựa trên các đƣờng cong phù hợp với phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4. Các thí nghiệm đƣợc lặp lại ít nhất ba lần một cách độc lập.
2.6.2. Thử nghiệm sinh học in vitro ức chế enzyme α-glucosidase và ức chế enzyme
acetylcholinesterase
2.6.2.1. Ức chế enzyme α-glucosidase
Các hợp chất phân lập đã đƣợc kiểm tra hoạt tính ức chế α-glucosidase bởi Ting và cộng sự (2005) [101]. Các hợp chất thử nghiệm đƣợc hòa tan trong dimethylsulfoxit (DMSO) để tạo thành dung dịch gốc. p-NPG (p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside) (Sigma-Aldrich) và 0,2 U/mL α-glucosidase từ Saccharomyces cerevisiae (Sigma- Aldrich) đƣợc chuẩn bị từ 100 mM dung dịch đệm potassium phosphate pH 6,8.
Sự hấp thụ tia cực tím ở bƣớc sóng 410 nm đƣợc đo bằng máy BIOTEK. IC50 đƣợc tính tốn từ phân tích hồi quy phi tuyến tính dựa trên các đƣờng cong dose- response.
2.6.2.2. Ức chế a enzyme acetylcholinesterase
Hoạt tính enzyme acetylcholinesterase (AChE) đƣợc xác định bằng xét nghiệm so màu dựa trên phƣơng pháp của Ellman.
Nồng độ các hợp chất thử nghiệm từ 1 - 256 µg/mL và đƣợc hòa tan trong DMSO và sau đó đƣợc pha loãng với đệm (50 mM Tris ‐ HCl, pH 8 chứa 0,1 M NaCl), 0,1 % bovine serum albumin (BSA), 25 µL acetylthiocholine iodide. Đĩa đƣợc ủ ở 25°C trong 15 phút. Sự hình thành anion 5-thio-2-nitrobenzoate màu vàng, có thể đƣợc phát hiện ở bƣớc sóng 405 nm. Mỗi thử nghiệm đƣợc thực hiện trong ba lần. Phần trăm ức chế AChE đƣợc xác định theo công thức:
Ức chế (%) = [(OD của đối chứng - OD của mẫu) / OD của đối chứng] x 100.
2.6.3. Nghiên cứu docking phân tử để chống ức chế α-glucosidase
Cấu trúc tinh thể của enzyme Saccharomyces cerevisiae α-glucosidase khơng
có sẵn trong ngân hàng dữ liệu protein (PDB), nên để hiểu đƣợc các tƣơng tác giữa phối tử-enzyme, cấu trúc ba chiều của α-glucosidase đƣợc xây dựng bằng mơ hình tƣơng đồng trên máy chủ web Swiss-Model (https: //swissmodel.expasy.org/).
Cấu trúc khn mẫu đƣợc tìm kiếm trên NCBI protein BLAST để tạo mơ hình cho protein cần thiết. Swiss-Model đã đề xuất cấu trúc tinh thể của enzyme isomaltase từ S. cerevisiae (PDB ID: 3AJ7) với 72,4% xác thực và 91% nghi vấn [121].
Các yếu tố lập thể của mơ hình đã đƣợc kiểm tra bằng sơ đồ Ramachandran, nó có thể đƣợc coi là một mơ hình tiềm năng cho các nghiên cứu docking tiếp theo (Hình 2.2). Dữ liệu thu đƣợc từ sơ đồ Ramachandran cho thấy dƣ lƣợng amino acid của mơ hình α-glucosidase nằm ở những vùng ƣa thích nhất, do đó, nó có thể đƣợc coi là một mơ hình có thể thực hiện đƣợc cho các nghiên cứu tiếp theo. Cấu trúc tinh thể của α- glucosidase trong ruột ngƣời tạo phức với chất ức chế acarbose (PDB ID: 3TOP) đƣợc lấy từ ngân hàng dữ liệu protein.
Hình 2.2: Phân tích đồ thị Ramachandran về cấu trúc của mơ hình Saccharomyces
cerevisiae α-glucosidase
Cấu trúc ba chiều của các hợp chất đã đƣợc thực hiện bởi Gaussview và việc tối ƣu hóa năng lƣợng đƣợc thực hiện trong Gaussian 09.
AutoDock Vina đã đƣợc sử dụng để thiết lập và thực hiện các phép tính docking bằng chƣơng trình PyRx [22],[103]. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu docking với giả định rằng có một protein cứng và xem xét cấu trúc không gian của các phối tử để phân tích hiệu ứng quy nạp của các hợp chất lai. Trong phân tích docking, vị trí liên kết đƣợc bao bọc trong một hộp có kích thƣớc x × y × z (25 Å × 25 Å × 25 Å) và tâm của đƣợc đặt tại x = 22,2262; y = - 8,1477; z = 23,9431 đối với enzyme α-glucosidase ở ruột ngƣời.
Các thơng số cịn lại đƣợc giữ ở mức mặc định của phần mềm. Autodock Vina đã đƣợc thực hiện để tìm ra 10 vị trí trong đó đƣa ra ƣớc tính năng lƣợng thấp nhất giữa phối tử và thụ thể. Kết quả đầu ra từ các nghiên cứu mơ hình AutoDock Vina đƣợc phân tích bằng Discovery Studio Visualizer.
2.6.4. Phân tích thống kê
Các thử nghiệm đƣợc thực hiện ít nhất là ba lần và các giá trị đƣợc biểu thị bằng giá trị trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Các giá trị của nồng độ ức chế 50% (IC50) đƣợc tính tốn từ phân tích hồi quy khơng tuyến tính dựa trên các đƣờng cong dose- response.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN