Kí hiệu chất IC50 (µg/mL)a Kí hiệu chất IC50 (µg/mL)a
1- MS1 >500 7- MS6 228,90±18,6 2- MS4 241,33±8,2 8- MS9 303,10±11,0 3- MS7 273,10±8,2 9- MS10 >500 4- MS5 246,49±18,7 10- MS11 449,53±5,2 5- MS3 43,92 ± 3,7 PC 8,58±0,9 6- MS12 93,91±5,4
a Giá trị là trung bình của ba lần lặp lại ± độ lệch chuẩn (SD)
Trong thử nghiệm khả năng sống của tế bào, tất cả các hợp chất thử nghiệm khơng cho thấy độc tính tế bào đối với tế bào RAW 264,7, ngoại trừ hợp chất MS3 làm giảm sự phát triển của tế bào 23,3% ở nồng độ 100 µg/mL (Hình 3.2).
Concentration (mg/mL) 500 100 20 Ce ll v ia bi li ty (% ) 0 20 40 60 80 100 1 2 3 4 5 Concentration (mg/mL) 500 100 20 Cell v iab ilit y (%) 0 20 40 60 80 100 6 7 8 9 10
Hình 3.2: Khả năng tồn tại của dòng tế bào RAW264.7 được xử lý bằng các hợp chất
phân lập từ Millettia speciosa.
1: Friedelin (MS1); 2: rotundic acid (MS4); 3: pedunculoside (MS7); 4: uvaol (MS5); 5: ursolic acid (MS3); 6: gypenoside XVII (MS12); 7: pterocarpin (MS6); 8: syringin (MS9); 9: daidzin (MS10) và 10: rutin (MS11). (Các tế bào đƣợc ủ ở 37°C trong môi trƣờng CO2).
3.4.2.2. Ức chế enzyme α-glucosidase
Trong số 10 hợp chất đƣợc phân lập, có bốn hợp chất (MS3, MS5, MS7 và
MS11) ức chế enzyme α-glucosidase ở khoảng nồng độ 1–256 µg/mL. Đặc biệt, các
hợp chất MS3, MS5 và MS11 cho thấy sự ức chế enzyme α-glucosidase tốt nhất với
giá trị IC50 lần lƣợt là 1,10; 1,96 và 2,2 µg/mL (Bảng 3.35). Ở 256 µg/mL, các hợp chất MS3, MS5 và MS11 ức chế enzyme α-glucosidase với mức ức chế tƣơng ứng là 99,0%; 92,5% và 85,0% (Bảng 3.36).
Hợp chất MS3 gây ra sự ức chế 91,5% đối với enzyme α-glucosidase ở 4 µg/mL (Bảng 3.36). Kết quả so sánh với hợp chất đối chứng Acarbose (IC50 = 169,8 µg/mL) cho thấy các hợp chất MS3, MS5 và MS11 có sự ức chế enzyme α-glucosidase mạnh. Hợp chất MS7 gây ra sự ức chế 60,5% đối với enzyme α-glucosidase ở 256 µg/mL
Bảng 3.35: Kết quả đánh giá hoạt tính (IC50) ức chế enzyme α-glucosidase bởi các hợp chất phân lập từ Millettia speciosa
Hợp chất IC50 (µg/mL)a Fold change 1-MS1 > 256 < 0,663 2-MS4 > 256 < 0,663 3-MS7 184,89±10,05 0,918 4-MS5 1,96±0,09 86,632 5-MS3 1,10±0,05 154,363 6-MS12 > 256 <0,663 7-MS6 > 256 <0,663 8-MS9 > 256 <0,663 9-MS10 > 256 <0,663 10-MS11 2,2±0,09 77,534 Positive controlb 169,80±7,05 1,000 a
Giá trị là trung bình của ba lần thử nghiệm ± độ lệch chuẩn (SD). bAcarbose: đối chứng dƣơng.
Các hợp chất còn lại MS1, MS4, MS6, MS9, MS10, MS12 cho thấy rất ít hoặc khơng có sự ức chế đối với enzyme α-glucosidase ở khoảng nồng độ thử nghiệm. Ở 256 µg/mL, sự ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất đó đƣợc xác định là
23% (MS1); 33% (MS4); 34% (MS12); 25% (MS6); 12% (MS9) và 22% (MS10) tƣơng ứng. (Bảng 3.36).
Bảng 3.36: Sự ức chế α-glucosidase của các hợp chất phân lập từ Millettia speciosa Nồng độ (µg/mL) % ức chế 1-MS1 2-MS4 3-MS7 4-MS5 5-MS3 6-MS12 256 23 33 60,5 92,5 99 34 64 20 4 32 85 98 21 16 13 1 9,5 83 91,5 17 4 1 1 3 76,5 95 5 1 1 1 1 37,5 48,5 1 Nồng độ (µg/mL) % ức chế 7-MS6 8-MS9 9-MS10 10-MS11 Acarbosea 256 25 12 22 85 72 64 12 9 10 82,5 23 16 3 8 4 78 18 4 3 1 0 74 5 1 0 0 0 34,5 0
3.4.2.3. Ức chế enzyme acetylcholinesterase
Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học về ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE), cho thấy rutin (MS11) có khả năng ức chế enzyme AChE với IC50 là 256,0 µg/mL và ursolic acid (MS3) có khả năng ức chế AChE mạnh nhất với IC50 là 8,0 µg/mL. Tuy nhiên khả năng ức chế enzyme AChE của MS3 và MS11 yếu hơn nhiều
so với đối chứng dƣơng - donepezil (IC50 = 0,025 µg / mL) (Bảng 3.37). Các hợp chất khác thể hiện sự ức chế enzyme AChE yếu trong khoảng nồng độ thử nghiệm.
Bảng 3.37: Nồng độ ức chế nửa tối đa (IC50) đối với sự ức chế enzyme AchE bởi các hợp chất phân lập từ Millettia speciose
Kí hiệu chất IC50 (µg/mL) Kí hiệu chất IC50 (µg/mL)
1- MS1 >256 7-MS6 >256 2-MS4 >256 8-MS9 >256 3-MS7 >256 9-MS10 >256 4-MS5 >256 10-MS11 256 ± 7.89 5-MS3 8.0 ± 0.75 PCa 0.025 ± 0.007 6-MS12 >256
aPC: đối chứng dƣơng - donepezil
3.4.3. Nghiên cứu docking phân tử khả năng ức chế enzyme α-glucosidase
Các nghiên cứu docking phân tử đã đƣợc thực hiện để kiểm tra sự tƣơng tác giữa
α-glucosidase và các hợp chất có hoạt tính (MS3, MS5, MS7 và MS11). Kết quả
nghiên cứu docking phân tử cho thấy hợp chất ursolic acid (MS3) có năng lƣợng liên kết tự do (- 9,1 kcal/mol) thấp hơn các hợp chất rutin (MS11) (-8,7 kcal/mol), uvaol
(MS5) (-8,9 kcal/mol) và pedunculoside (MS7) (-5,0 kcal/mol).
Các hợp chất MS3, MS5 và MS11 đều có năng lƣợng liên kết tự do thấp hơn
acarbose (-7,9 kcal/mol). Giá trị năng lƣợng gắn kết càng âm thì liên kết tƣơng ứng càng bền. Do đó, kết quả cho thấy rằng các hợp chất có hoạt tính liên kết dễ dàng với
α-glucosidase hơn là acarbose (Hình 3.3). Điều này hồn tồn phù hợp với kết quả thu
đƣợc từ các thí nghiệm in vitro. Dƣ lƣợng tƣơng tác của các hợp chất thu đƣợc từ mơ phỏng docking phân tử đƣợc trình bày trong bảng 3.38.
Nhóm hydroxyl (C3-OH) của ursolic acid (MS3) nằm ở túi kỵ nƣớc, đƣợc bao quanh bởi các gốc của Asp215 và Glu277 tạo thành các liên kết phân cực bền vững (Hình 3.4A). Do đó, vị trí hoạt động khơng bị chiếm bởi các phân tử nƣớc. Trƣớc khi
liên kết với chất ức chế, các phân tử nƣớc này xúc tác quá trình thủy phân của enzyme với sự có mặt của glucose. Các phân tử nƣớc cũng có nhiệm vụ bắc cầu các nhóm carboxylate của dƣ lƣợng xúc tác Glu và Asp, và tham gia vào quá trình thủy phân. Các phân tử nƣớc khác đƣợc cho là tạo thành một bể chứa nƣớc và cung cấp nƣớc cho quá trình thủy phân tiếp theo. Vì vậy, mơi trƣờng xung quanh chủ yếu là kỵ nƣớc, giúp tăng khả năng di chuyển của chúng. Những cơ sở lý thuyết này đều đã đƣợc trình bày trong nghiên cứu của Yamaoto và cộng sự, trên cơ sở cấu trúc isomaltase từ
S.cerevisiae [121].
Tƣơng tự, nhóm hydroxyl của uvaol (MS5) (C28-OH) và rutin (MS11) (C7-OH) hình thành liên kết bền vững với Asp352, giúp không bị thay thế bởi các phân tử nƣớc (Hình 3.4B và Hình 3.4C). Tuy nhiên, trong cấu trúc của hợp chất pedunculoside
(MS7), các nhóm hydroxyl khơng thể tạo ra tƣơng tác phân cực với các amino acid
trong túi kỵ nƣớc (Hình 3.4D), do đó cho thấy hợp chất này có thể ức chế chức năng của các enzyme đích ở nồng độ cao hơn đối chứng dƣơng (acarbose), phù hợp với kết quả của thử nghiệm kháng α-glucosidase trong in vitro.
Hình 3.3: Hợp chất MS3 (màu xanh lá cây - hoạt động mạnh nhất) và acarbose (màu xám -
Bảng 3.38: Tƣơng tác của các hợp chất mô phỏng docking phân tử
Hợp chất Dƣ lƣợng tƣơng tác liên kết hydrogen a
3 - MS7 Ser157, Tyr158 (Unfavorable bump), Asp242, His280, Asp307 (Unfavorable bump), Pro312, Phe314, Arg315, Glu411 (Unfavorable bump).
4 - MS5 Leu313 (Unfavorable bump), Arg315, Asp352, Gln353.
5 - MS3 Tyr158 (Pi-Alkyl), Asp215, Val216 (alkyl), Glu277, Phe303 (Pi-alkyl), Arg315, Glu411 (Unfavorable bump).
10 - MS11 Ser157, Ser240, Asp242, Phe303 (pi-pi stacked), Asp307 (pi-anion), Phe314, Ser311, Agr315, Asp352, Gln353, Glu411, Arg442.
PC (Acarbose) Asp69, Asp215, Ser240, Asp242, His280, Phe303, Pro312, Arg315 (Unfavorable bump), Arg442 (Unfavorable bump).
aSer: Serine; Tyr: Tyrosine; Asp: Aspartic acid; His: Histidine; Pro: Proline; Phe: Phenylalanine; Glu: Glutamic acid; Arg: Arginine; Val: Valine; Gln: Glutamine; Leu: Leucine.
Hình 3.4: Các hợp chất được gắn vào túi liên kết của enzyme α-glucosidase
(A: Hợp chất ursolic acid (MS3) – hoạt động mạnh nhất; B: Hợp chất rutin (MS11); C: Hợp chất uvaol (MS5); D: Hợp chất pedunculoside (MS7)- kém hoạt động nhất).
Một tƣơng tác liên kết hydrogen quan trọng khác đã đƣợc quan sát thấy giữa các hợp chất đƣợc nghiên cứu với Tyr158, His280, và vòng 310–315 nằm ở lối vào của túi vị trí hoạt động [121]. Phân tích chi tiết cho thấy hợp chất pedunculoside
(MS7) có liên kết hydrogen với Ser157, Tyr158, Asp242, His280, Asp307, Pro312,
uvaol (MS5) và α-glucosidase. Hợp chất ursolic acid (MS3) tạo ra hai tƣơng tác pi-
alkyl với Tyr158, Phe303 và một alkyl với Val216, khác với uvaol (MS5), cho thấy
tƣơng tác này có thể làm tăng cƣờng khả năng ức chế của hợp chất này. Hợp chất rutin
(MS11) tạo thành một chất xếp chồng pi-pi (Phe303), một pi-anion (Asp307) và một
số liên kết hydrogen trong tƣơng tác với Ser157, Ser240, Asp242, Phe314 Ser311, Agr315, Gln353, Glu411, Arg442 (Bảng 3.38, Hình3.4)
Các hợp chất MS3, MS5 đã đƣợc nghiên cứu về sự ức chế của α-glucosidase
trong ruột của con ngƣời. Kết quả docking phân tử cho thấy hợp chất MS5 có năng
lƣợng liên kết tự do thấp hơn (- 9,0 kcal/mol) so với hợp chất MS3 (-7,4 kcal/mol). Hai tƣơng tác quan trọng đã đƣợc quan sát thấy giữa hợp chất MS5 và enzym α- glucosidase trong ruột ngƣời, các chuỗi bên của Asp1157 tạo thành liên kết hydrogen
với nhóm C3-OH, và C23 tạo ra tƣơng tác pi-sigma với Trp1369. Những tƣơng tác này cũng đƣợc quan sát thấy giữa acarbose trong nghiên cứu của Ren và cộng sự [88]. Tƣơng tác với Trp1369 chỉ quan sát đƣợc trong hợp chất MS3 ở C29 và C28 [nhóm acid (C17-COOH)] tạo thành liên kết hydrogen với Lys1460. Lys1460 hoạt động nhƣ một bazơ vì nó nhận một proton từ nhóm -COOH của MS3 (Hình 3.5A).
Các mơ hình dƣợc lý trong tƣơng tác với enzyme α-glucosidase trong ruột ngƣời đƣợc tạo ra bằng cách sử dụng ZINCPharmer trực tuyến [53], có bốn khu vực kỵ nƣớc (HP) và một chất nhận liên kết hydrogen (HBA) trong hợp chất MS3, chất nhận liên kết hydrogen chỉ đƣợc trình bày trên C17-COOH. Hợp chất MS5 có ba HP và một
HBA. Chất nhận liên kết hydrogen đƣợc chỉ ra trên C28-OH của hợp chất MS5 (Hình 3.5B).
Hình 3.5: A) Liên kết của MS3, MS5 với α-glucosidase trong ruột người và B) Mô
hình dược chất (HBA: chất nhận liên kết hydrogen được mô tả dưới dạng mũi tên màu vàng nâu; HP: khu vực kỵ nước được mơ tả như hình cầu màu xanh lá cây)
3.4.4. Thảo luận
Trong số các hợp chất đã đƣợc thử hoạt tính sinh học thì MS3, MS5, MS12 và MS6 (lần đầu tiên đƣợc tìm thấy trong rễ của loài Milletia speciosa) thể hiện sự ức
chế đáng kể đối với việc sản sinh ra NO. MS3 (ursolic acid) ức chế mạnh việc sản sinh ra NO trong các tế bào RAW 264,7 đƣợc kích thích bằng lipopolysaccharide (LPS). Tuy nhiên, nó cũng gây ra độc tính tế bào vừa phải đối với các tế bào khác. Ursolic acid đã đƣợc biết đến với hoạt tính chống ung thƣ và tác dụng đa chức năng trong việc tạo khối u, biệt hóa tế bào và tác dụng chống tạo mạch [58],[126]. Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự (2019), ursolic acid đƣợc phân lập từ Phryma leptostachya var. asiatica đƣợc phát hiện có hiệu quả trong việc hình thành NO tới 80,6% ở nồng độ 40 µg/mL [52].
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù hợp chất MS3 (ursolic acid) là chất ức chế sự sản sinh NO tốt nhất trong nghiên cứu này, nhƣng nó cũng gây độc tế bào đối với tế bào đại thực bào RAW 264.7 ở nồng độ cao hơn 100 µg/mL (Hình 4). Kết quả là, hợp chất MS12 (IC50 = 93,91 µg/mL) có khả năng là một chất ức chế mạnh hơn và không cho thấy độc tính tế bào so với hợp chất MS3, chất này có thể tiếp tục nghiên cứu để có thể sử dụng làm thuốc kháng viêm.
Trong số bốn triterpene loại ursane, hợp chất MS4, MS7, MS5 ức chế sản sinh
ra NO trong tế bào đại thực bào RAW 264,7 mà không gây độc tế bào và cũng cho thấy sự ức chế tốt hơn so với hợp chất MS1, một triterpene loại oleana xuất hiện trong rễ của M. speciosa. Các hợp chất phenolic MS6, MS9, MS10 và MS11 có hoạt tính ức chế sự sản sinh ra NO của chúng kém hơn so với hoạt tính của triterpene loại ursane (Bảng 3.34). Trong số các hợp chất phenolic, pterocarpin (MS6) cho thấy IC50 là 228,90 µg/mL, đây là lần đầu tiên đƣợc phát hiện có hoạt tính đối với sự sản sinh ra NO. Ngƣợc lại, các hợp chất syringin (MS9) và rutin (MS11) cho thấy ảnh hƣởng không đáng kể đến sự sản sinh ra NO trong các tế bào RAW 264,7. Kim.D và cộng sự (2019) đã chỉ ra rằng sự sản sinh ra NO không bị chặn bởi syringin, ngay cả ở nồng độ cao 1000 µM và hợp chất này đƣợc mô tả nhƣ một chất điều biến miễn dịch có tác dụng chống dị ứng hơn là tác dụng kháng viêm [52]. Bên cạnh đó, rutin cũng có khả năng làm trung gian tổng hợp NO trong tế bào nội mô tĩnh mạch rốn của con ngƣời bằng cách gây ra biểu hiện mRNA eNOS, tổng hợp protein và hoạt tính của isoenzyme nội mơ (eNOS) [105].
Trong số các hợp chất đƣợc phân lập, các hợp chất MS3, MS5, MS7 và MS11 ức chế đáng kể α-glucosidase. Đặc biệt, các hợp chất MS3, MS5 và MS11 cho thấy sự ức chế tốt nhất với IC50 thấp hơn so với đối chứng dƣơng (acarbose) (IC50 = 169,80 µg/mL). Các hợp chất khác MS1, MS4, MS6, MS9, MS10 và MS12 không cho thấy sự ức chế tốt đối với α-glucosidase trong khoảng nồng độ 1–256 µg / mL (Bảng 3.37 và 3.35). Dubey S. và cộng sự (2017) đã mơ tả hoạt tính kháng α-glucosidase của rutin (MS11), trong nghiên cứu của họ, sự ức chế α-glucosidase bởi rutin thay đổi trong
phạm vi 10,61–52,56% ở nồng độ thử nghiệm 50–250 µg/mL [29].
Ngồi ra, uvaol (MS5) và ursolic acid (MS3) là triterpen loại ursane, chúng thể hiện ức chế mạnh nhất đối với enzyme α-glucosidase. Ursolic acid (MS5) cho thấy sự ức chế enzyme α-glucosidase mạnh nhất; với IC50 là 1,10 µg/mL và ức chế hoàn toàn enzym này (91,5%) ở 4 µg/mL. Kết quả phát hiện phù hợp với dữ liệu đƣợc nghiên cứu trƣớc đó bởi H. Ding và cộng sự (2018) [24], nghiên cứu này cho thấy oleanolic acid và ursolic acid có giá trị IC50 lần lƣợt là (6,35 ± 0,02) × 10−6 và (1,69 ± 0,03) × 10−5 mol/L và ursolic acid ức chế enzyme α-glucosidase theo cách không cạnh tranh. Ursolic acid và oleanolic acid đƣợc phân lập từ các lồi Salvia, đƣợc phát hiện có tác dụng ức chế mạnh enzyme α-glucosidase [49]. Uvaol và ursolic acid có cùng bộ xƣơng là triterpnoid loại ursane và chúng khác với nhóm thế C-28, ở đó nhóm -CH2OH cho uvaol và nhóm -COOH cho ursolic acid. Acid ursolic và uvaol đƣợc phân lập từ
Clinopodium taxifolium cho thấy sự ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50
tƣơng ứng là 72,7 và 521,0 µg/mL [72]. Theo Wang và cộng sự (2020), ursolic acid (một mẫu thƣơng mại) và acarbose đƣợc thử nghiệm chống lại α-glucosidase và giá trị IC50 của chúng đƣợc xác định là 213 µg/mL đối với ursolic acid và 1160 µg/mL đối với acarbose [111]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, hoạt động ức chế enzyme α- glucosidase của MS4 và MS7 có nguồn gốc từ rễ của M. speciose là lần đầu tiên đƣợc
báo cáo và đánh giá. Điều thú vị là hợp chất MS7 (pedunculoside) còn đƣợc gọi là
triterpenoid loại ursane; nhƣng nó cho thấy hoạt động ức chế enzyme α-glucosidase
vừa phải (Bảng 3.37). Tƣơng tự nhƣ cấu tạo hóa học của uvaol, hợp chất MS4 và MS7 là dẫn xuất của ursolic acid với nhóm hydroxyl liên kết với C23 và C19; tuy nhiên hợp chất MS7 cũng có liên kết ester ở C-28 với glucose. Sự khác biệt trong cấu trúc của MS4 và MS7 có thể dẫn đến việc giảm hiệu lực của α-glucosidase đối với các hợp
Phƣơng pháp docking phân tử đƣợc sử dụng để dự đoán vị trí liên kết của các hợp chất đƣợc nghiên cứu trong vị trí hoạt động của enzyme a-glucosidase. Thơng qua phân tích docking phân tử bởi Autodock Vina, bốn hợp chất MS7, MS5, MS3 và
MS11 đã đƣợc tìm thấy để chèn vào túi kỵ nƣớc của enzyme α-glucosidase và đƣợc
bao quanh bởi nhiều amino acid phân cực. Ursolic acid (MS3) đƣợc phát hiện chủ yếu tƣơng tác với sáu gốc amino acid (Tyr158, Asp215, Val216, Glu277, Phe303 và Arg315). Ba amino acid (Arg315, Asp352, Gln353) hình thành liên kết hydrogen với uvaol (MS5) và sự tƣơng tác đƣợc quan sát thấy giữa rutin (MS11) và mƣời hai phần dƣ. Các kết quả này cho thấy những điểm tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đây về ức chế enzyme α-glucosidase [29],[82],[117],[134]. Theo Dubey (2017), hợp chất
rutin đã chứng minh hằng số ức chế là 67,62 µm và năng lƣợng liên kết là -7,01 với enzyme α-glucosidase (PBD ID: 3A4A) bằng tƣơng tác khơng cộng hóa trị [29].
Nghiên cứu docking phân tử của các chất ức chế với enzyme α-glucosidase, các tƣơng tác của MS3, MS5, MS7 và MS11 tại túi vị trí hoạt động đã đƣợc quan sát và
đƣa ra lời giải thích cho các kết quả in vitro. Những dữ liệu này cho thấy rằng các chất có hoạt tính sinh học phân lập đƣợc từ rễ của M. speciosa có thể là các phân tử dẫn
đƣờng đầy hứa hẹn cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc phát triển các loại thuốc kháng viêm và chống tiểu đƣờng.
CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƢỢC TỪ HẠT CÂY BON BO (Alpinia blepharocalyx) OH OCH3 O H3CO OCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' Flavokawain A - (AS1) OH O H3CO OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9