Cân 2 gam mẫu sữa bột cho vào ống ly tâm 50 ml.
Thêm 10 ml 5% TCA trong nước cất và 10 ml ACN, đậy nắp kín. Ống mẫu được đặt vào trong buồng máy siêu âm trong 10 phút.
Sau đó, mẫu được lắc thật đều trong 10 phút, và làm lạnh bằng nước đá khoảng 30 phút.
Ly tâm ống mẫu trong 10 phút với tốc độ 4000 vòng / phút.
Đường nền
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch 5% TCA trong nước, sau đó lọc lớp dung dịch giữa sau khi ly tâm mẫu. Dịch lọc được cho vào bình định mức 25ml.
Dùng dung dịch NaOH 2N để chỉnh pH của dịch lọc thành 11.5. Sau đó dùng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5 định mức cho đến vạch mức ta được dung dịch mẫu I.
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5, sau đó lọc dung dịch mẫu I. Dịch lọc được cho vào erlen 100 ml.
Thêm vào erlen 25 ml chloroform, lắc kỹ, để yên 2 giờ cho dung dịch mẫu tách thành hai lớp.
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5, lấy lớp trên của dung dịch lọc sạch, ta thu được dung dịch II.
Rút 2.5 ml hoà tan với 7.5 ml dung dịch nền Natri Acetate 1.5M pH 11.5 ta được dung dịch III, sau đó tiến hành đo với máy điện hoá ANALYZER SQW-505 với các thông số như hình 3.12. Thực hiện 3 lần đo.
Dùng micro pipet rút V l dung dịch chuẩn melamine 200 ppm cho vào dung dịch mẫu III, tiến hành đo với máy ANALYSER SQF-505, thực hiện 3 lần đo. Khi đó, dung dịch mẫu III được thêm chuẩn với nồng độ x (được tính theo công thức 3.3.2).
Thể tích dung dịch chuẩn được thêm vào tuỳ thuộc vào hàm lượng melamine trong mẫu phân tích, trước hết ta đo dung dịch mẫu, thu được giá trị IA của mẫu, thay vào phương trình đường chuẩn để ước lượng hàm lượng melamine có trong mẫu, từ đó chọn lượng melamine thêm vào tương đương.
Tiến hành tương tự, đo dung dịch III được thêm chuẩn với nồng độ là 2x, và 3x. Máy ANALYSER SQF-505 sẽ tính ra giá trị CMELAMINE (nồng độ MELAMINE ) trong mẫu bằng phương pháp thêm chuẩn.
Từ đó, ta tính được hàm lượng melamine trong mẫu theo công thức sau:
m k V C W MELAMINE o MELAMINE (3.4) Trong đó:
WMELAMINE: hàm lượng melamine trong mẫu (mg/kg)
CMELAMINE: nồng độ melamine trong dung dịch mẫu đo (ppm) k: hệ số pha loãng của mẫu đo so với mẫu ban đầu cân
Vo: thể tích định mức mẫu ban đầu – thể tích dung dịch I (ml) m: khối lượng mẫu ban đầu (g)