Với dung dịch nền là dung dịch natri axetat 1.5M, pH 11.5, và các thông số của máy cực phổ như hình 3.12, ta tiến hành đo dung dịch melamine với các nồng độ khác nhau ở mức ppb để dựng đường chuẩn melamine.
Bảng 3.10: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE tại các giá trị nồng độ ppb khác nhau. STT Cmelamine (ppb) IA (nA) 1 160 1830 2 240 3365 3 320 4893 4 400 6422 5 480 7969
Hình 3.13: Các sóng cực phổ Melamine với nồng độ khác nhau.
Với giá trị trong bảng 3.10 và các công thức từ (2.3) đến (2.12), ta tính ra được bảng giá trị hồi qui 3.11.
Bảng 3.11: Bảng kết quả giá trị phân tích hồi qui khi xây dựng đường chuẩn MELAMINE ở mức nồng độ ppb bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505.
Thông số Giá trị thô Làm tròn
a -1238.20 -1238 b 19.16875 19.169 Sresidue 6.00832755 S(a) 8.06101731 S(b) 0.02375 t 0.95, f =3 3.182 U(a) 25.6501571 26 U(b) 0.0755725 0.076 r 0.9999977
Hình 3.14: Đường chuẩn Melamine ở mức nồng độ ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505.
Từ giá trị bảng 3.11, ta biểu diễn phương trình hồi qui của melamine như sau:
1238 169 19 MELAMINE A C I . (3.1) 3.4.2 Đường chuẩn ở mức nồng độ ppm:
Với dung dịch nền là dung dịch natri axetat 1.5M, pH 11.5, và các thông số của máy cực phổ như hình 3.12, ta tiếp tục tiến hành đo dung dịch melamine với các nồng độ khác nhau ở mức ppm để dựng đường chuẩn melamine.
Bảng 3.12: Bảng kết quả của quá trình quét thế dung dịch MELAMINE tại các giá trị nồng độ ppm khác nhau. STT Cmelamine (ppm) IA (nA) 1 1.6128 21530 2 3.2256 38660 3 4.8384 54920 4 6.4512 71210 5 8.0640 87270
Hình 3.14: Các sóng Melamine ở các mức nồng độ ppm, đo bằng máy ANALYZER SQF-505.
Với giá trị trong bảng 3.12 và các công thức từ (2.3) đến (2.12), ta tính ra được bảng giá trị hồi qui 3.13.
Bảng 3.13: Bảng kết quả giá trị phân tích hồi qui khi xây dựng đường chuẩn MELAMINE ở mức nồng độ ppm bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505.
Thông số Giá trị thô Làm tròn
a 5509.00 5509 b 10170.5109 10170 Sresidue 355.053987 S(a) 372.383763 S(b) 69.6167714 t 0.95, f =3 3.182 U(a) 1184.92513 1185 U(b) 221.520567 222 r 0.99992973
Hình 3.15: Đường chuẩn Melamine ở mức nồng độ ppm, đo bằng máy ANALYZER SQF-505.
Từ giá trị bảng 3.13, ta biểu diễn phương trình hồi qui của melamine như sau:
5509 10170 MELAMINE A C I (3.2) 3.4.3 Kết luận:
R hiệu chỉnh của cả hai đường chuẩn lần lượt bằng 0.99999 và 0.99925 cho thấy độ tuyến tính rất cao.
3.4.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của máy bằng phương pháp tín hiệu đối với tiếng ồn (S/N = signal to noise) [12]: bằng phương pháp tín hiệu đối với tiếng ồn (S/N = signal to noise) [12]:
Giá trị tiếng ồn được tính toán dựa trên chiều cao các peak xuất hiện trong mẫu trắng (là dung dịch nền Natri Acetate 1.5M pH 11.5) tại vị trí lân cận với vị trí xuất hiện peak Melamine (V = – 200 mV đến – 400 mV).
LOD được ước tính là giá trị nồng độ chuẩn với cường độ peak bằng 3 lần giá trị tiếng ồn.
LOQ được ước tính là giá trị nồng độ chuẩn với cường độ peak bằng 10 lần giá trị tiếng ồn.
Bảng 3.14: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch nền trắng bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505.
STT
N N S=3.N S=10.N
(nA) (nA) (nA) (nA)
1 40.32 53.709 161.127 537.090 2 118.20 3 40.30 4 92.43 5 20.26 6 17.04 7 21.58 8 17.84 9 50.12 10 119.00 Từ phương trình đường
Hình 3.16: Tín hiệu nền của dung dịch trắng MELAMINE. Kiểm định lại giá trị LOD và LOQ bằng thực nghiệm:
Rút 9 l dung dịch melamine chuẩn 200 ppm cho vào 25 ml dung dịch nền natri axetat 1.5M pH 11.5, với thông số máy đo cực phổ như hình 3.11, ta thu được sóng cực phổ của melamine như hình 3.14.
0 0V C V CĐO ĐO (3.3.1) ĐO ĐO V V C C 0 0 (3.3.2) Trong đó:
VĐO là thể tích dung dịch khi đo với máy cực phổ (ml) C0 là nồng độ dung dịch chuẩn (ppb)
V0 là thể tích rút dung dịch chuẩn để thực hiện phép đo (ml) CĐO (MELAMINE) = 72 ppb
Rút 11.5 l dung dịch melamine chuẩn 200 ppm cho vào 25 ml dung dịch nền natri axetat 1.5M pH 11.5, với thông số máy đo cực phổ như hình 3.11, ta thu được sóng cực phổ của melamine như hình 3.15. Từ công thức (3.3.2), ta tính được CĐO
(MELAMINE) = 92.72 ppb
Hình 3.17: Sóng Melamine ở mức nồng độ LOD = 72ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505.
Hình 3.18: Sóng Melamine ở mức nồng độ LOQ = 92.72 ppb, đo bằng máy ANALYZER SQF-505.
Vậy giá trị LOD và LOQ của máy có giá trị được nêu ra trong bảng 3.14 là đúng với thực tế.
3.5. Qui trình phân tích melamine trong mẫu sữa :
3.5.1 Mô tả qui trình và công thức tính [5], [6], [9], [10]:
Cân 2 gam mẫu sữa bột cho vào ống ly tâm 50 ml.
Thêm 10 ml 5% TCA trong nước cất và 10 ml ACN, đậy nắp kín. Ống mẫu được đặt vào trong buồng máy siêu âm trong 10 phút.
Sau đó, mẫu được lắc thật đều trong 10 phút, và làm lạnh bằng nước đá khoảng 30 phút.
Ly tâm ống mẫu trong 10 phút với tốc độ 4000 vòng / phút.
Đường nền
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch 5% TCA trong nước, sau đó lọc lớp dung dịch giữa sau khi ly tâm mẫu. Dịch lọc được cho vào bình định mức 25ml.
Dùng dung dịch NaOH 2N để chỉnh pH của dịch lọc thành 11.5. Sau đó dùng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5 định mức cho đến vạch mức ta được dung dịch mẫu I.
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5, sau đó lọc dung dịch mẫu I. Dịch lọc được cho vào erlen 100 ml.
Thêm vào erlen 25 ml chloroform, lắc kỹ, để yên 2 giờ cho dung dịch mẫu tách thành hai lớp.
Làm ướt giấy lọc bằng dung dịch Natri Acetate 1.5M pH 11.5, lấy lớp trên của dung dịch lọc sạch, ta thu được dung dịch II.
Rút 2.5 ml hoà tan với 7.5 ml dung dịch nền Natri Acetate 1.5M pH 11.5 ta được dung dịch III, sau đó tiến hành đo với máy điện hoá ANALYZER SQW-505 với các thông số như hình 3.12. Thực hiện 3 lần đo.
Dùng micro pipet rút V l dung dịch chuẩn melamine 200 ppm cho vào dung dịch mẫu III, tiến hành đo với máy ANALYSER SQF-505, thực hiện 3 lần đo. Khi đó, dung dịch mẫu III được thêm chuẩn với nồng độ x (được tính theo công thức 3.3.2).
Thể tích dung dịch chuẩn được thêm vào tuỳ thuộc vào hàm lượng melamine trong mẫu phân tích, trước hết ta đo dung dịch mẫu, thu được giá trị IA của mẫu, thay vào phương trình đường chuẩn để ước lượng hàm lượng melamine có trong mẫu, từ đó chọn lượng melamine thêm vào tương đương.
Tiến hành tương tự, đo dung dịch III được thêm chuẩn với nồng độ là 2x, và 3x. Máy ANALYSER SQF-505 sẽ tính ra giá trị CMELAMINE (nồng độ MELAMINE ) trong mẫu bằng phương pháp thêm chuẩn.
Từ đó, ta tính được hàm lượng melamine trong mẫu theo công thức sau:
m k V C W MELAMINE o MELAMINE (3.4) Trong đó:
WMELAMINE: hàm lượng melamine trong mẫu (mg/kg)
CMELAMINE: nồng độ melamine trong dung dịch mẫu đo (ppm) k: hệ số pha loãng của mẫu đo so với mẫu ban đầu cân
Vo: thể tích định mức mẫu ban đầu – thể tích dung dịch I (ml) m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
3.5.2 Kết quả đo mẫu sữa bột dinh dưỡng VINAMILK:
Thực hiện các bước như miêu tả trong phần 3.5.1 cho 3 lượng cân của các mẫu sữa bột dinh dưỡng VINAMILK, lượng cân và các số liệu về mẫu được mô tả chi tiết trong bảng 3.15. Sóng cực phổ của các mẫu thu được đều không có sự hiện diện của peak melamine, xem hình 3.19.
Như vậy, các mẫu sữa bột của VINAMILK không chứa melamine.
Kết quả xác định được so sánh với kết quả của TRUNG TÂM 3 (xem phụ lục 1) là như nhau: KHÔNG PHÁT HIỆN MELAMINE trong mẫu sữa bột VINAMILK này.
Mẫu sữa bột này được xem là mẫu trắng dùng để khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp.
Bảng 3.15: Bảng kết quả xác định melamine trong mẫu sữa bột dinh dưỡng Vinamilk.
STT m (g) Vo (ml) k Cmelamine
(ppm) Wmelamine (mg/kg)
1 1.9980 25 10 0 0
2 2.0015 25 10 0 0
Hình 3.19: Sóng cực phổ của các mẫu sữa bột dinh dưỡng vinamilk (không phát hiện MELAMINE)
3.5.3 Khảo sát giới hạn phát hiện của phương pháp (method detection limit = MDL) và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL - method quantitation MDL) và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL - method quantitation limit):
Sử dụng mẫu sữa bột không chứa melamine (đã được kiểm định melamine trong phần 3.5.2 và kết quả là không chứa melamine) làm mẫu thí nghiệm.
Cân 10 mẫu khác nhau, thực hiện quá trình xử l ý mẫu như phần 3.5.1, và sau đó tiến hành đo lần lượt từng mẫu với máy cực phổ theo thông số như hình 3.11, tương tự
phần 3.4.1, ta thu được bảng kết quả 3.16 và các sóng cực phổ nền mẫu trắng trong hình 3.20 và 3.21.
Bảng 3.16: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch mẫu trắng bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505.
STT
N N S=3.N S=10.N
(nA) (nA) (nA) (nA)
1 67.41 66.601 199.803 666.01 2 53.86 3 17.76 4 41.74 5 72.99 6 53.86 7 117.7 8 126.0 9 41.70 10 72.99 Từ phương trình đường
Hình 3.21: Sóng cực phổ của các mẫu sữa bột dinh dưỡng vinamilk trắng melamine
3.6. Khảo sát hiệu suất thu hồi R% và độ chính xác RSD của phương pháp tại mức giới hạn định lượng: giới hạn định lượng:
- Cân 3 lượng cân sữa bột (xem bảng 3.17) cho vào 3 ống ly tâm 50 ml, thêm vào 150 l dung dịch melamine 200ppm, trộn đều. Sau đó tiến hành xử lý mẫu như miêu tả trong phần 3.5.1, và đo dung dịch mẫu với máy cực phổ ta thu được các sóng như hình 3.18.
Bảng 3.17: Bảng kết quả giá trị đo các dung dịch mẫu có thêm melamine bằng máy cực phổ ANALYZER SQF 505 STT m (g) Wmelamine (mg/kg) thêm Vo (ml) k Cmelamine (ppm) Wmelamine (mg/kg) đo R% 1 4.9980 6.002401 25 10 0.101 5.052021 84% 2 5.0015 5.998201 25 10 0.106 5.29841 88% 3 5.0010 5.9988 25 10 0.102 5.09898 85%
Hình 3.22: Sóng cực phổ của melamine trong dung dịch mẫu và các sóng cực phổ của mẫu được thêm chuẩn
Tên các sóng từ thấp đến cao: - Sóng màu đỏ: mẫu sữa bột có melamine.
- Sóng xanh lá cây: mẫu được
thêm C melamine = 100 ppb
- Sóng màu tím: mẫu được thêm C melamine = 200 ppb
- Sóng màu xanh ngọc: mẫu được thêm C melamine = 300 ppb
Hình 3.23: Đường chuẩn của dung dịch mẫu được thêm melamine theo phương pháp thêm chuẩn và kết quả nồng độ melamine máy tính được theo phương pháp này. - Vậy tại mức nồng độ melamine = 101 ppb (tương đương với giới hạn định lượng của máy), hiệu suất thu hồi đạt trong khoảng từ 84% đến 88%. Theo phụ lục 4, thì kết quả hiệu suất thu hồi này đạt yêu cầu.
- Tính RSD (relative standard deviation) theo công thức:
% 100 x S RSD x (3.5) RSD = 2.57%
Theo phụ lục 3, thì giá trị RSD này đạt yêu cầu, vậy độ chính xác của phương pháp này đạt yêu cầu.
IA (A)
Chương 4: KẾT LUẬN 4.1. Xác định tổng đạm trong mẫu sữa bột:
Sử dụng dung dịch nền là hỗn hợp dung dịch Natri Acetate 0.2M pH 4.5 và HCHO theo tỉ lệ 2:1 để đo hàm lượng ion NH4
+
bằng máy điện hoá ANALYZER SQF-505 với phương pháp đo SQW_F (sóng vuông quét nhanh trên điện cực giọt chậm rơi tự do), quét thế từ Vstart – 400 mV đến Vstop – 1100 mV, bước thế Vstep là 2 mV, biên độ xung Vpulse là 10 mV, thời gian giọt thuỷ ngân là 5000 ms, ta thu được tín hiệu hình gauss đối xứng và ổn định tại vị trí thế – 892 mV.
Mẫu sữa bột được xử l ý bằng phương pháp vô cơ hoá ướt, sau đó điều chỉnh dung dịch mẫu về điều kiện phân tích tối ưu, hoà tan với dung dịch nền, và tiến hành xác định tổng đạm trên máy điện hoá ANALYZER SQF-505 theo các thông số như trên, ta thu được kết quả đạt độ đúng, độ chính xác, và độ lặp lại rất tốt.
Đồng thời, phương pháp này cho kết quả nhanh hơn, giảm bớt lượng hoá chất và dụng cụ tiêu tốn so với phương pháp Kjeldahl.
4.2. Xác định melamine trong mẫu sữa bột:
Sử dụng dung dịch nền Natri Acetate 1.5M pH 11.5 và máy điện hoá ANALYZER SQF-505 với thông số tối ưu như sau: phương thức đo là PSA_F (tích góp hoà tan – sóng vuông quét nhanh trên điện cực giọt chậm rơi tự do), thế bắt đầu quét Vstart – 100 mV, thế kết thúc Vstop là – 1000 mV, bước thế Vstep là 10 mV, biên độ xung Vpulse là 30 mV, thời gian giọt thuỷ ngân là 5000 ms, thế tích góp Velectrolize 0 mV, thời gian tích góp Telectrolize 6s và Tstabilize 1s, ta thu được tín hiệu peak hình gauss đối xứng và ổn định tại vị trí thế –283 mV.
Mẫu sữa bột được xử l ý đơn giản hơn so với phương pháp sắc ký: mẫu được hoà tan trong dung dịch môi trường acid TCA để các protein bị kết tụ, sau đó ly tâm lạnh để tách hoàn toàn các protein ra khỏi dung dịch mẫu. Ta thực hiện quá trình chiết lỏng
– lỏng với dung môi Chloroform để loại bỏ chất béo. Và quan trọng là dung dịch mẫu sau xử l ý phải được chỉnh pH về 11.5 để tiến hành đo sóng trong dung dịch nền và thông số máy tối ưu như đã trình bày ở trên. Kết quả phân tích Melamine thu được đạt độ đúng, độ chính xác và hiệu suất thu hồi đạt yêu cầu tốt.
So sánh với kỹ thuật phân tích Melamine bằng LC-MS/MS thì giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của kỹ thuật phân tích Melamine bằng điện hoá (tích góp hoà tan – sóng vuông quét nhanh trên điện cực giọt chậm rơi tự do) cao hơn (xem phụ lục 1, giới hạn phát hiện của trung tâm 3 công bố là 50 ppb, trong khi ở đây là 75 ppb) 50% giá trị.
Tuy nhiên, qui trình phân tích mẫu sữa bột đơn giản, chi phí không cao, thời gian phân tích nhanh, đây chính là ưu điểm của kỹ thuật điện hoá này.
4.3. Kiến nghị:
- Đối với tổng đạm: nghiên cứu thêm khả năng phân tích hàm lượng đạm ở mức độ vết. Có thể ứng dụng trong hóa sinh để phân tích hàm lượng đạm trong dịch não tủy.
- Đối với Melamine: cần phát triển quy trình trên các loại mẫu khác nhau, ví dụ mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu bột ngũ cốc …
- Cần tìm hiểu và xác định cơ chế các phản ứng xảy ra trong quá trình xác định N tổng bằng phương pháp cực phổ, tìm hiểu tính chất điện hóa của Melamine để giải thích cơ chế cho phương pháp phân tích này.
Tiếng Việt
[1] Bộ Quốc phòng, Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga (2007), Tính năng kỹ thuật và khả năng ứng dụng của máy phân tích nhanh “ANALYZER SQF-505” do trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga & HP Co.,Ltd chế tạo, Tp Hồ Chí Minh.
[2] Bộ Y tế (2008), Quyết định số38/2008/QĐ-BYT về“Quy định mức giới hạn tối đa của melamin nhiễm chéo trong thực phẩm”, Hà Nội.
[3] GS.TS. Nguyễn Thanh Khuyến (2004), Các kỹ thuật phân tích điện hoá, giáo trình tác giả tự biên, Tp Hồ Chí Minh.
[4] PGS.TS. Cù Thành Long (2008), Phương pháp thống kê trong thực nghiệm hoá học, giáo trình tác giả tự biên, Tp Hồ Chí Minh.
Tiếng Anh
[5] Bureau of Chemical Safety, Food Directorate, Health Products and Food Branch (2008), Determination of Melamine in Various Milk-Containing Products, A PAHO/WHO Collaborating Center for Food Contamination Monitoring, Canada.
[6] D. Julian McClements (1998), Analysis of Food Products, Chenoweth Lab, Australia.
[7] Douglas A Skoog, F. James, Timothy A. Nieman Holler . Nieman (1998),
Principles of Instrumental Analysis, Fifth Edition, Harcourt Brace & Company, United States of America.
[8] EG&G Princeton Applied Research Application Note F-2, Applications of voltammetry to the food industry, USA.
[9] Min Cai and Yun Zou (2008), Trace-Level Analysis of Melamine in Milk Products on Agilent 7890A/5975C GC/MSD Using a New Agilent J&W DB-5ms Ultra
Chemistry, Canada.
[11] Test Procedures Committee of Market Administrator (June 1991), Protein Determination, United State Department of Agriculture, USA.
[12] Wisconsin Department of Natural Resources Laboratory Certification Program (April 1996), ANALYTICAL DETECTION LIMIT GUIDANCE & Laboratory Guide