CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.4. Khảo sát hiệu quả phân giải lân khó tan của nấm vùng rễ
lỏng
Mục đích: đánh giá hiệu quả phân giải lân khó tan của các chủng nấm vùng rễ dã quỳ phân lập được. Từ đó chọn lọc các chủng có hoạt tính phân giải lân khó tan cao, có khả năng ứng dụng vào sản xuất chế phẩm lân vi sinh.
Thí nghiêm 1: Khảo sát hiệu quả phân giải Ca3(PO4)2 (TCP) của các chủng nấm vùng rễ dã quỳ phân lập được trong môi trường lỏng
Bước 1: Nhân giống cấp 1:
- Mục đích: nâng cao mật số nấm, đảm bảo sức sống và độ tương đồng ban đầu giữa các chủng nấm khi cấy trong môi trường nuôi cấy lỏng.
- Tiến hành: Sử dụng các vỏ hũ sữa chua sạch và tiệt trùng (cồn 960 và UV), mỗi vỏ được cho vào 100ml môi trường nuôi cấy lỏng đã khử trùng (Môi trường nuôi cấy A không bổ sung agar và sử dụng Ca3(PO4)2 với nồng độ 1g/l). Dùng que cấy cấy bào tử của mỗi chủng nấm phân lập được lên bề mặt môi trường nuôi cấy lỏng, số đơn
28
vị thí nghiệm tương đương số chủng nấm khảo sát và được lặp lại 2 lần. Thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng. Sau 3 – 5 ngày, khi nấm đã thích nghi với mơi trường nuôi cấy lỏng và phát triển mạnh thì tiến hành bước 2.
Bước 2: Tiến hành khảo sát hiệu quả hịa tan lân khó tan Ca3(PO4)2 của các chủng nấm phân lập được:
- Mục đích: đánh giá hiệu quả phân giải lân khó tan Ca3(PO4)2 của các chủng nấm vùng rễ phân lập được, chọn ra một số dịng có hoạt tính phân giải lân cao để tiếp tục khảo sát hiệu quả phân giải lân với nguồn lân rất khó hịa tan (phân Ninh Bình).
- Tiến hành: Sử dụng các vỏ hũ sữa chua sạch và tiệt trùng (cồn 960 và UV), mỗi vỏ được cho vào 100ml môi trường lỏng đã khử trùng (Môi trường nuôi cấy A không bổ sung agar và sử dụng Ca3(PO4)2 với nồng độ 1g/l). Tiếp theo, dùng micropipette với đầu code được cắt rộng ở phía đầu hút cẩn thận 1ml dịch nuôi cấy nấm cấp 1 (bước 1) trên bề mặt môi trường lỏng, đảm bảo lấy được khuẩn ty và bào tử của nấm, đặt đầu code chạm thành vỏ sữa chua và bơm từ từ dịch nuôi cấy cấp 1 vào môi trường ni cấy để khảo sát, số đơn vị thí nghiệm tương đương với số chủng nấm khảo sát và 3 lần lặp lại với 3 đối chứng không cấy nấm. Tiến hành đo và ghi nhận sự thay đổi của pH và nồng độ lân hịa tan trong dịch ni cấy qua các ngày bằng phương pháp xác định nồng độ lân hòa tan trong nước (Murphy và Riley, 1962; Torres- Dorante et al., 2004). Thời gian theo dõi: 2 ngày thu kết quả 1 lần (kể cả ngày 0). Xác định lượng lân phân giải cực đại của mỗi chủng nấm, cũng như thời gian và khoảng giá trị pH mà mỗi chủng nấm đạt được giá trị phân giải cực đại. Chọn ra một số chủng nấm có hoạt tính phân giải lân khó tan Ca3(PO4)2 mạnh nhất cho việc đánh giá hiệu quả phân giải lân ở thí nghiệm tiếp theo.
- Chỉ tiêu theo dõi: pH và nồng độ lân hịa tan thay đổi trong dịch ni cấy nấm qua các ngày (hai ngày lấy chỉ tiêu một lần).
Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả hịa tan lân trong phân Ninh Bình của một số chủng nấm có hoạt tính phân giải lân cao phân lập được.
Bước 1: Nhân giống cấp 1: Tương tự ở bước 1 trong thí nghiệm 1, chỉ khác thay đổi nguồn lân khó tan Ca3(PO4)2 bằng phân Ninh Bình, nồng độ 1g/100ml.
Bước 2: Tiến hành khảo sát hiệu quả hịa tan lân khó tan trong phân Ninh Bình của các chủng nấm có hoạt tính phân giải lân cao phân lập được:
29
- Mục đích: đánh giá hiệu quả phân giải lân rất khó hịa tan trong phân Ninh Bình và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm có hoạt tính phân giải lân cao phân lập được.
- Tiến hành và chỉ tiêu theo dõi: tương tự bước 2 trong thí ngiệm 1. Tuy nhiên thay thế nguồn lân khó tan Ca3(PO4)2 bằng phân Ninh Bình, nồng độ 1g/100ml.
30