3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.10 Nghiên cứu các phƣơng pháp và điều kiện cố định S cerevisiae
Để xác định đƣợc mật độ tế bào nấm men đƣợc cố định trên chất mang BC chúng tôi tiến hành: Sử dụng kéo đã vơ khuẩn cắt 4 góc (mỗi góc với thiết diện 1x1mm) miếng BC cố định và cho vào trong ống nghiệm chứa sẵn 10ml nƣớc cất vô trùng. Dập mẫu. Tiến hành định lƣợng bằng phƣơng pháp đếm gián tiếp [3,13].
3.3.9 Phƣơng pháp hóa lý
3.3.9.1 Đo pH
Sử dụng máy đo pH.
3.3.9.2 Phƣơng pháp xác định nồng độ chất khô
Sử dụng khúc xạ kế cầm tay, đơn vị đo là oBx.
3.3.9.3 Xác định hàm lƣợng cồn
Xác định hàm lƣợng cồn bằng chƣng cất và bình tỷ trọng.
3.3.9.4 Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng
Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng bằng phƣơng pháp Anthrone.
3.3.10 Nghiên cứu các phƣơng pháp và điều kiện cố định S. cerevisiae trên chất mang BC mang BC
Trong luận văn này chúng tôi tiến hành hai phƣơng pháp cố định sau:
Phƣơng pháp 1: Phƣơng pháp bẫy – hấp phụ. Phƣơng pháp 2: Phƣơng pháp nhốt.
3.3.10.1 Phƣơng pháp bẫy – hấp phụ
Nguyên tắc: Sử dụng BC nhƣ một giá thể nuôi cấy vi khuẩn. Phƣơng pháp hấp phụ để bẫy giống vi khuẩn cần cố định hấp thụ lên chất mang BC. Chất mang BC đƣợc trƣơng nở bởi dịch môi trƣờng tƣơi và tế bào giống vi khuẩn, lúc này chất mang BC này nhƣ một giá thể nuôi cấy vi khuẩn và đƣợc tạo điều kiện thích hợp để vi khuẩn phát triển thông qua thời gian ủ.
Phƣơng pháp cố định tế bào: tế bào đƣợc cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC) bằng phƣơng pháp bẫy - hấp phụ gồm hai giai đoạn: hấp phụ vi khuẩn trên bề mặt BC và bẫy tăng sinh trong chất mang BC.
- Giai đoạn hấp phụ: Trong khoảng 30 phút đầu tiên sau khi ngâm BC trong
dịch tế bào, BC sẽ trƣơng nở về trạng thái ban đầu, đồng thời sẽ hấp phụ tế bào vào hệ thống sợi bên trong cũng nhƣ trên bề mặt bên ngoài.
- Giai đoạn bẫy tăng sinh: Kế tiếp giai đoạn hấp phụ. Các tế bào đã đƣợc hấp
phụ ở giai đoạn trên tiếp tục phát triển và tăng sinh trên giá đỡ BC [5],[8].
Tiến hành phƣơng pháp bẫy – hấp phụ
+ Bƣớc 1: Xử lý dịch giống vi sinh vật cần cố định.
- Chuẩn bị giống S. cerevisiae thuần khiết trên môi trƣờng thạch nghiêng. - Nhân giống: nhân giống cấp I, tiếp đến nhân giống cấp II.
- Ly tâm thu sinh khối giống.
+ Bƣớc 2: Phƣơng pháp bẫy – hấp phụ nấm men trên chất mang BC
Chuyển BC đã xử lý (đƣợc cắt nhỏ với kích thƣớc 2cmx1cm, 2cmx2cm, 2cmx3cm) và vô trùng, sinh khối nấm men sau ly tâm thu đƣợc vào trong bình erlen 250 ml trong đó chứa 100 ml dịch môi trƣờng Hansen tƣơi. Với tỷ lệ BC phối trộn tƣơng ứng với kích thƣớc 2cmx1cm, 2cmx2cm, 2cmx3cm là 3:2:1 (45, 30, 15 miếng BC).
Ba phƣơng pháp hấp phụ đƣợc sử dụng nhƣ sau:
- Phương pháp A: ngâm trong thời gian 20-30 phút đến khi miếng BC trƣơng
nở hoàn toàn trong dịch giống.
- Phương pháp B: tƣơng tự phƣơng pháp A nhƣng kết hợp sử dụng chế độ lắc
200 vòng/phút để tăng khả năng hấp phụ tế bào nấm men vào chất mang.
- Phương pháp C: tƣơng tự phƣơng pháp A nhƣng tăng số vịng lắc lên là 300
Cơng thức thí nghiệm: Kích thƣớc BC (cm) Phƣơng pháp 2cmx1cm 2cmx2cm 2cmx3cm A A1 A2 A3 B B1 B2 B3 C C1 C2 C3
(Mỗi thí nghiệm tiến hành đƣợc lặp lại 3 lần)
BC sau khi cố định đƣợc chuyển vào các đĩa Petri vô trùng. Đặt các đĩa Petri chứa BC cố định vào tủ ấm 30oC (nhiệt độ phù hợp với sinh lý tế bào nấm men).
- Trong các phƣơng pháp A, B, C xác định phƣơng pháp hấp phụ nào cho hiệu quả cố định cao nhất.
Để chứng minh khả năng cố định tế bào vi sinh vật của chất mang BC, chúng tôi đã sử dụng chế phẩm BC sau khi cố định 2 ngày cắt lát mỏng và quan sát dƣới kính hiển vi điện tử quét tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Cần Thơ.
3.3.10.2 Phƣơng pháp nhốt chủ động vi sinh vật vào bên trong BC
Phƣơng pháp nhốt chủ động tế bào nấm men vào bên trong BC đƣợc thực hiện nhờ lực hút trong bình lọc của máy lọc, dịch lỏng và các phân tử có kích thƣớc nhỏ hơn lỗ màng dƣới tác dụng của lực hút di chuyển xuống bình chân khơng. Trong khi đó tế bào vi sinh vật có kích thuớc lớn hơn sẽ đƣợc giữ lại trong mạng lƣới sợi cellulose.
Bƣớc 1: Chuẩn bị BC
- Quy trình tạo BC cho phƣơng pháp nhốt cũng tƣơng tự nhƣ mục 3.3.4 nhƣng thay vì lên men trong bảy ngày thì với phƣơng pháp này chúng tôi lên men tạo BC.
trong hai ngày. Việc lên men BC trong hai ngày nhằm tạo BC có độ dày tƣơng đối là 2mm.
- Xử lý BC: quy trình xử lý nhƣ mục 3.3.6 sau đó vắt cho ráo nƣớc, cắt miếng BC thành hình trịn với Ø = 11cm và đem hấp tiệt trùng.
Bƣớc 2: Xử lý dịch giống vi sinh vật cần cố định.
Chuẩn bị giống S. cerevisiae thuần khiết trên môi trƣờng thạch nghiêng. Nhân giống: nhân giống cấp I, tiếp đến nhân giống cấp II.
Bƣớc 3: Chuẩn bị bình hút chân khơng và phễu lọc
Bình hút chân không và phễu lọc phải đƣợc tiệt trùng.
Bƣớc 4: Lấy màng BC của bƣớc 1 đặt lên phễu sứ, sau đó đổ dịch giống cấp 2
vào phễu và bật máy hút chân không để tiến hành nhốt tế bào nấm men vào trong mạng lƣới cellulose. Sử dụng dịch mơi trƣờng sau q trình nhốt (dịch mơi trƣờng trong bình lọc) để tráng dịch nhân giống cịn sót lại trong erlen. Q trình kết thúc khi dịch giống trong phễu đã chảy hết xuống bình lọc.
Trong quá trình lọc phải đốt đèn cồn, sau mỗi lần thay miếng BC mới phải tiệt trùng lại bình hút chân khơng và phễu lọc bằng cách dùng cồn 70o lau sạch, đồng thời dùng bông thấm cồn 90o để đốt dụng cụ, để dụng cụ nguội rồi tiến hành lọc tiếp.
Tiến hành xong bƣớc 4 nhanh chóng chuyển BC (có tế bào nấm men cố định) vào đĩa Petri đã tiệt trùng.
Tất cả thao tác đƣợc tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để loại trừ khả năng lây nhiễm.
Quá trình xác định số tế bào đƣợc cố định trên BC đƣợc tiến hành nhƣ mục 3.3.8.