CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.8. Phương pháp tách chiết và tinh chế polysaccharide
2.5.8.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide
Nguyên tắc:
Sử dụng kỹ thuật chiết rắn (mẫu nguyên liệu) - lỏng (dung môi nước).
Thực nghiệm:
Quá trình thực nghiệm được trình bày trên Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đờ tách chiết polysaccharide thơ
2.5.8.2. Phương pháp tinh chế polysaccharide
Nguyên tắc:
Sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng và sắc ký cột để tinh chế polysaccharide.
Hình 2.7. Sơ đờ tinh chế polysaccharide
2.5.8.3. Phương pháp định lượng polysaccharide
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng thủy phân polysaccharide thành monosaccharide, monosaccharide tạo màu với phenol, dung dịch tạo thành có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng λ = 490 nm.
Thực nghiệm:
a. Xây dựng đường chuẩn
- Cân chính xác 0,2500 g D-glucose cho vào bình định mức 250 mL rồi định mức bằng nước cất ta được dung dịch A. Như vậy, nồng độ dung dịch D-glucose là 1 mg/mL (1000 μg/mL).
- Lấy 50 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu được dung dịch D-glucose có nồng độ 100 μg/mL (dung dịch B).
- Lần lượt lấy 0; 25; 50; 75; 100 mL dung dịch B pha thành 100 mL thu được dung dịch D-glucose có nồng độ là 0; 25; 50; 75; 100 μg/mL.
- Lấy 125 mL dung dịch A pha thành 500 mL thu được dung dịch D-glucose có nồng độ 250 μg/mL (dung dịch C).
- Lần lượt lấy 50; 60; 70; 80 mL dung dịch C pha thành 100 mL thu được dung dịch D-glucose có nồng độ là 125; 150; 175; 200 μg/mL.
- Mỗi mẫu lấy 1 mL cho vào ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch này ở bước sóng 490 nm, thu được các giá trị độ hấp thụ quang.
- Từ các kết quả thu được, xây dựng đường chuẩn.
b. Đo mẫu thực
- Lấy 1 mL dịch chiết nước cho vào ống nghiệm có nút đậy kín. Thêm vào mỗi ống nghiệm 1 mL dung dịch phenol 5%, 5 mL dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm.
- Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sơi trong 2 phút, sau đó làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
- Đo độ hấp thụ quang (A) của các dung dịch PS này ở bước sóng 490 nm. Kết hợp với phương trình đường chuẩn (Phụ lục: Hình P1), suy ra hàm lượng PS có trong mẫu.