CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5. Phương pháp nghiên cứu
2.5.7. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) định lượng các hợp chất
chất phenol
Nguyên tắc:
Sắc ký lỏng là phương pháp được dùng để tách các chất khó bay hơi ra khỏi nhau khi cho hỗn hợp đi qua cột sắc ký, dựa trên tương tác tương đối giữa sự hấp phụ với pha tĩnh trong cột và sự giải hấp phụ nhờ pha động dung môi. Dung dịch mẫu được bơm vào cùng với dung môi gọi là pha động. Khi dung dịch mẫu chảy cùng dung môi đi qua pha tĩnh, các cấu tử của dung dịch mẫu này sẽ di chuyển phụ thuộc vào tương tác khơng hóa trị của cấu tử với pha tĩnh. Các tương tác hóa học của pha tĩnh và mẫu với pha động quyết định mức độ di chuyển và phân tách các cấu tử trong mẫu. Khi các cấu tử đi qua khỏi cột sắc ký, chúng được chuyển thành tín hiệu peak ghi lại thành sắc đồ bằng detectơ. Các chất tách ra khỏi cột để định tính và định lượng sẽ dựa vào chất chuẩn.
Thực nghiệm:
- Chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký:
Cân chính xác 0,5 g mẫu, phân tán trong 30 mL ethanol 70°, chiết 3 lần, ở nhiệt độ 70°C, trong 90 phút, và được hỗ trợ bằng máy siêu âm. Gộp các dịch chiết, cô quay chân khơng để thể tích dung dịch về dưới 50 mL, lọc qua giấy Whatman No.4. Định mức đến vạch 50 mL bằng dung môi ethanol 70°, thu được dịch chiết để định lượng gallic acid, quercetin, quercitrin, và hespiridin trong mẫu nghiên cứu.
- Điều kiện phân tích sắc ký
Dựa vào tài liệu tham khảo, cấu trúc hóa học của các hợp chất nghiên cứu và điều kiện phân tích mẫu hiện có của phịng thí nghiệm, chúng tơi tiến hành khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký để định lượng 4 hợp chất phenol như sau:
- Cột sắc ký: C18 (Inertsil ODS-3 (5µm particle size, i.d. 4,6 x 250 mm)) - Pha động: hỗn hợp dung dịch gồm H2O:MeOH:Acetonitrile:CH3COOH = 45:40:15:1.
- Tốc độ dòng: 1 mL/phút - Thời gian phân tích: 10 phút - Bước sóng: 280 nm
Thẩm định phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu:
- Độ tuyến tính và khoảng nồng độ tuyến tính (Linearity and range)
- Độ đúng (Accuracy): Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và tính thơng qua hiệu suất thu hồi:
𝐻𝑖ệ𝑢 𝑠𝑢ấ𝑡 𝑡ℎ𝑢 ℎồ𝑖 (%) = 𝐶2−𝐶1
𝐶0 (2.4) C2 : Hàm lượng chất trong mẫu xác định sau khi thêm chuẩn (µg/mL) C1: Hàm lượng chất có trong mẫu (µg/mL)
C0: Hàm lượng thêm vào (µg/mL)
- Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Xác định LOD dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu (S/N). Việc xác định tỉ lệ S/N được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được của mẫu thử có nồng độ chất phân tích thấp đã biết với đáp ứng của mẫu trắng từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện được. Tỉ lệ S/N được chấp nhận để xác định giới hạn phát hiện. Từ đó suy giới hạn định lượng LOQ.
𝐿𝑂𝑄 = 10
3 𝐿𝑂𝐷 (2.5)
- Cách tính tốn hàm lượng
Xây dựng phương trình đường chuẩn: chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ tăng dần. Tiến hành phân tích HPLC, dựa vào diện tích peak và nồng độ tương ứng để xây dựng phương trình đường chuẩn:
𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 (2.6) Trong đó:
y: Diện tích peak
x: Nồng độ chất chuẩn (µg/mL) a, b: Hệ số phương trình hồi quy
Tiến hành phân tích mẫu thực: thu được diện tích peak (Smẫu) thay vào phương trình hồi quy ta được nồng độ (Cmẫu).
𝐶 = 𝐶𝑚ẫ𝑢
𝑚𝑚ẫ𝑢× 𝑉𝑚ẫ𝑢 (2.7) Trong đó:
C: Hàm lượng chất tính trên 1 gam
Cmẫu: Nồng độ mẫu thực tính theo phương trình hồi quy (µg/mL) m mẫu: Khối lượng mẫu cao (g)
Đường chuẩn của các chất chuẩn gallic acid, quercetin, quercitrin, hesperidin tại phụ lục: Hình P4; P5; P6 và P7.