CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Xác định cấu trúc, định lượng và hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharide
3.4.3. Hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharide từ nấm Ophiocordyceps
sobolifera
Hàm lượng các hợp chất polysaccharide trong cao nước chiếm từ 72 -86% (khối lượng polysaccharide *100/khối lượng cao nước), cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của cao nước có thể là do polysaccharide quyết định.
Polysaccharides đã thu hút được sự chú ý lớn của các nhà khoa học trong những thập kỷ qua. Sự đa dạng về cấu trúc và các chức năng sinh học tiềm năng của chúng mang lại những đặc tính độc đáo, PS được coi là những nguồn dinh dưỡng và có các đặc tính sinh học vơ cùng quý giá. Các nghiên cứu trước cho thấy, polysaccharide chiết xuất từ Ophiocordyceps sobolifera cung cấp các hoạt tính sinh học đáng kể như chống oxy hóa, và làm giảm tổn thương thận ở chuột.
Vì vậy, chúng tơi tiến hành đánh giá hoạt tính của polysaccharide từ nấm
Ophiocordyceps sobolifera .
Các cao chiết nước ở nhiệt độ khác nhau sẽ chứa polysaccharide có cấu trúc khác nhau, vì vậy nhiệt độ chiết là yếu tố quyết định hoạt tính của polysaccharide thu được. Các mẫu polysaccharide thu được ở các nhiệt độ chiết i (oC) khác nhau được ký hiệu là PS-Ti.
3.4.3.1. Lực chống oxy hóa tổng theo mơ hình phosphor molybdenum của các mẫu PS-Ti
Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng lực chống oxy hóa của các mẫu PS-Ti đều tăng đáng kể với sự gia tăng nồng độ từ 0,1 đến 1,5 mg/mL (Hình 3.29). Khi tăng nhiệt độ chiết i từ 60°C đến 80°C thì lực chống oxy hóa của mẫu PS-Ti tăng. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ chiết i từ 90°C lên 100°C, lực chống oxy hóa tổng của PS-Ti có giảm nhưng khơng đáng kể. Hoạt tính của polysaccharide chịu ảnh hưởng bởi cấu trúc không gian và khối lượng phân tử của chúng. Sự gia tăng nhiệt độ chiết có thể tăng hiệu suất chiết, đồng thời thu được polysaccharide có khối lượng phân tử cao [3].
Lượng chất chống oxy hóa được biểu thị bằng lượng tương đương của gallic acid hoặc ascorbic acid của các mẫu PS-Ti ở nồng độ 1,5 mg/mL được trình bày trên Bảng 3.23. Theo kết quả xác định ở mục 3.2.1.1., tại nồng độ 0,5 mg/mL hàm lượng chất chống oxy hóa trong 1 g cao nước là 12,72 ± 0,29 mg gallic acid /g mẫu) (n=3) hoặc 7,87 ± 0,11 mg ascorbic acid/g mẫu (n=3). Về mặt khối lượng, đã xác định được polysaccharide chiếm 86% trong cao nước. Số liệu trên bảng này cho thấy polysaccharide tinh khiết cung cấp lượng chất chống oxy hóa cao hơn cao nước, chứng tỏ polysaccharide là thành phần chủ yếu tạo nên hoạt tính chống oxy hóa của cao nước.
Hình 3.29. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết i đến lực chống oxy hóa tổng
của các mẫu PS-Ti tương ứng ở các nồng độ khác nhau
Bảng 3.23. Hàm lượng chất chống oxy hóa trong các mẫu PS-Ti (i là nhiệt độ chiết)
Mẫu mg gallic acid/g mg ascorbic acid/g
PS-T60 0,1183 ± 0,0011 0,1105 ± 0,0004 PS-T70 0,1393 ± 0,0009 0,1190 ± 0,0007 PS-T80 0,1454 ± 0,0021 0,1215 ± 0,0006 PS-T90 0,1404 ± 0,0007 0,1194 ± 0,0009 PS-T100 0,1400 ± 0,0013 0,1193 ± 0,0002 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0,18 0,2 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1 1,5 M ật đ ộ q u an g Nồng độ (mg/mL) PS-T60 PS-T70 PS-T80 PS-T90 PS-T100
3.4.3.2. Khả năng bắt gốc tự do DPPH của các mẫu PS-Ti
Kết quả trong Bảng 3.23 chỉ ra rằng, hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu polysaccharide chiết được ở các nhiệt độ khác nhau là khác nhau. Khi chiết ở nhiệt độ cao hơn trong khoảng từ 60°C đến 80°C sẽ nhận được polysaccharide có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn và hoạt tính chống oxy hóa bắt đầu giảm xuống từ nhiệt độ 90°C và 100°C. Điều này cũng thể hiện trong Bảng 3.24, một cách tương đối có sự tương ứng giữa hoạt tính chống oxy hóa và sự đóng góp hàm lượng chất chống oxy hóa có trong các mẫu PS-Ti.
Bảng 3.24. Tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH (%) của các PS-Ti từ O. sobolifera
Mẫu Nồng độ (mg/mL) IC50 (mg/mL) n = 3 0,4 0,6 0,8 1,0 2,0 2,5 PS-T60 21,02 27,08 31,42 48,57 72,67 75,71 1,06 ± 0,01 PS-T70 18,58 28,57 31,44 49,02 69,53 81,74 1,05 ± 0,02 PS-T80 16,52 23,79 40,68 51,36 78,75 93,85 0,97 ± 0,01 PS-T90 15,52 26,20 40,90 50,87 79,12 91,75 0,99 ± 0,01 PS-T100 10,68 27,62 32,65 48,45 78,16 91,28 1,05 ± 0,01
Theo nghiên cứu của Lu và cộng sự [64], tỉ lệ bắt gốc tự do DPPH của PS từ nấm O. sobolifera được khảo sát ở nồng độ 1 mg/mL là 55,6%, mẫu nấm đang nghiên cứu trong cơng trình này thấp hơn một chút, là 48,45%. Ở nồng độ 2,5 mg/mL, các mẫu PS-Ti đều bắt trên 75% gốc tự do, chứng tỏ các mẫu PS này đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa.
Giá trị IC50 của các PS-Ti nằm trong khoảng từ 0,97 mg/mL đến 1,06 mg/mL. Có thể thấy rằng, hoạt tính chống oxy hóa của PS từ mẫu nấm đang nghiên cứu gần bằng với PS từ một số nghiên cứu khác về loài C. sinensis và C. militaris (giá trị IC50 của PS từ nấm C. sinensis nuôi trồng, C. sinensis tự nhiên và C. militaris lần lượt là 0,93 mg/mL; 1,23 mg/mL [24]; 1,15 mg/mL [44]).
Mặt khác, do mẫu PS-T100 có giá trị IC50 là 1,05 ± 0,01 mg/mL và khối lượng chiết được là nhiều nhất. Mẫu PS-T80 có hoạt tính cao hơn với giá trị IC50 là 0,97 ± 0,01 mg/mL. Vì vậy đây là một các lý do mà chúng tôi đã chọn hai mẫu PS-T100 và
Tiểu kết mục 3.4.
- Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu polysaccharide chiết được ở các nhiệt độ khác nhau là khác nhau, với giá trị IC50 ở trong khoảng từ 0,97 mg/mL đến 1,06 mg/mL và đều gần giống các kết quả nghiên cứu trước đây về các loài Cordyceps.
- Mẫu chiết ở nhiệt độ 100°C là PS-T100, có giá trị IC50 là 1,05 ± 0,01 mg/mL và khối lượng chiết được nhiều nhất, được đưa vào xác định cấu trúc của một đoạn mạch.
Kết quả đã xác định được polysaccharide này có cấu trúc hetero polysaccharide, bao gồm các đơn vị lặp lại giống nhau của D-glucose và D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 2,29 × 105 Da. Các kết quả phổ FT-IR, 1D và 2D NMR chỉ ra một polysaccharide mới từ O. sobolifera, bao gồm các đơn vị [→ 3) -β-D-Glcp- (1 → 3) -α- D-Manp- (1 → 3) -β-D-Glcp- (1 → 3) -α-D-Manp- (1 → 3) -β-D-Glcp- (1 →]n.
- Mẫu chiết ở nhiệt độ 80oC là PS-T80, có giá trị IC50 là 0,97 ± 0,01 mg/mL, có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong các mẫu PS-Ti, cũng có thành phần monosaccharide bao gồm các đơn vị lặp lại giống nhau của D-glucose và D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 7,4 ×104 Da có các đơn vị cấu trúc là [→3)-β-D-glucopyranoside- (1→;→3)-α-D-mannopyranoside-(1→;→3)-β-glucopyranoside-(1→]n.
Cả hai cấu trúc polysaccharide này đều được xác định lần đầu tiên trong loài
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu, Luận án đã đạt được một số nội dung chính như sau: 1. Ở điều kiện pH =7, nhiệt độ 25°C, thành phần môi trường nuôi cấy là glucose: 47,12 g; KH2PO4: 1,69 g; MgSO4: 0,74 g; dịch chiết ve sầu: 52,2 mL, đã thu nhận được khối lượng sinh khối nấm O. sobolifera từ 0,806 ÷ 0,880 g, trong đó chứa hàm lượng PS từ 5,119 ÷ 5,561%, tổng các hợp chất phenol từ 12,025 ÷12,933 mg GA/g và tổng flavonoid từ 7,920÷ 8,309 mg QE/g.
2. Cao nước và cao ethanol từ O. sobolifera thể hiện hoạt tính chống oxy hóa
in vitro gần bằng nhau trong 2 mơ hình: phosphor molybdenum (thơng qua lực chống
oxy hóa tổng), mơ hình bắt gốc tự do DPPH (thơng qua giá trị IC50) và gần bằng với
Ganoderma lucidum trồng tại Thừa Thiên Huế, Việt Nam. Hoạt tính chống oxy hóa
của mẫu cũng cao hơn so với loài Cordyceps sinensis cũng như G. lucidum trong các công bố trước đây. Mặt khác, lượng chất chống oxy hóa do cao nước cung cấp nhiều hơn khoảng 2 lần so với cao ethanol.
3. Cao nước từ O. sobolifera thể hiện tác dụng bảo vệ thận in vivo trên chuột nhắt trắng theo hướng chống oxy hóa tương tự như quercetin, dựa trên việc giảm hàm lượng creatinine và malondialdehyde và hồi phục các chỉ số này về giá trị sinh lý bình thường.
4. Đã phát hiện 4 hợp chất phenol có hàm lượng lớn nhất trong cao tồn phần của O. sobolifera. và xây dựng quy trình phân tích định lượng chúng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Đó là gallic acid 193,6 ± 0,02 µg/g; hàm lượng quercetin 142,07 ± 0,02µg/g; hàm lượng quercitrin 544,53 ± 0,03 µg/g; hàm lượng hesperidin 110,08 ± 0,01µg/g. Tổng của 4 hợp chất phenol này 990,27 µg/g. Quercetin, quercitrin, gallic acid, hesperidin đều là các chất chống oxy hóa mạnh với IC50 tương ứng là 1,93; 2,35; 7,51; 10,23 µg/mL, mạnh hơn nhiều so với curcumin, riêng hoạt tính của quercetin cịn mạnh hơn ascorbic acid.
5. Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu polysaccharide chiết được ở các nhiệt độ khác nhau là khác nhau, với giá trị IC50 ở trong khoảng từ 0,97 mg/mL đến 1,06 mg/mL và gần giống các kết quả nghiên cứu trước đây về các loài Cordyceps. Khi tăng nhiệt độ chiết từ 60°C đến 80°C, các mẫu polysaccharide thu được tương ứng có hoạt tính tăng lên, nhưng nếu tiếp tục tăng nhiệt độ chiết 90°C đến 100°C thì hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharide thu được có giảm khơng đáng kể.
6. Mẫu chiết ở nhiệt độ 100°C là PS-T100, có giá trị IC50 là 1,05 ± 0,01 mg/mL và khối lượng chiết được nhiều nhất, có cấu trúc hetero polysaccharide, bao gồm các đơn vị lặp lại giống nhau của D-glucose và D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 2,29.105 Da. Các kết quả phổ FT-IR, 1D và 2D NMR chỉ ra một polysaccharide mới từ O. sobolifera, bao gồm các đơn vị [→ 3) -β-D-Glcp- (1 → 3) -α-D-Manp- (1 → 3) -β-D-Glcp- (1 → 3) -α-D-Manp- (1 → 3) -β-D-Glcp- (1 →]n,.
Mẫu chiết ở nhiệt độ 80°C là PS-T80, có giá trị IC50 là 0,97 ± 0,01 mg/mL, có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất trong các mẫu PS-Ti, có thành phần monosaccharide bao gồm các đơn vị lặp lại giống nhau của D-glucose và D-mannose với khối lượng phân tử trung bình khoảng 7,4 x 104 Da, có các đơn vị cấu trúc là [→3)-β-D-glucopyranoside- (1→;→3)-α-D-mannopyranoside-(1→;→3)-β-D-glucopyranoside-(1→]n
Cả hai cấu trúc polysaccharide này đều lần đầu tiên được xác định trong lồi
NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
1. Đây là cơng trình nghiên cứu một cách có hệ thống về ni trồng, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của lồi nấm Ophiocordyceps sobolifera. Lần đầu tiên, điều kiện nuôi trồng nấm Ophiocordyceps sobolifera đã được khảo sát qua bố trí ma trận thí nghiệm, thu được các phương trình mơ hình và khảo sát tối ưu hóa để đạt hàm lượng hoạt chất cao nhất.
2. Cao nước từ Ophiocordyceps sobolifera thể hiện tác dụng bảo vệ thận in vivo trên chuột nhắt trắng theo hướng chống oxy hóa tương tự như quercetin, dựa trên việc giảm hàm lượng creatinine và malondialdehyde và hồi phục các chỉ số này về giá trị sinh lý bình thường. Đây là những kết quả bước đầu rất đáng khích lệ về hoạt tính sinh học của Ophiocordyceps sobolifera được nuôi cấy tại Việt Nam.
3. Cho đến nay, chưa tìm thấy cơng bố nào khác về hàm lượng các hoạt chất phenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh: gallic acid, quercitrin, quercetin và hesperidin trong các loài Cordyceps ngoài luận án này.
4. Hai cấu trúc polysaccharide mới đã lần đầu tiên được xác định trong lồi
DANH MỤC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BỐ
* Tạp chí quốc tế
1. Le Trung Hieu, Tran Van Khoa, Le Lam Son, Huynh Thi Ngoc Diep,
Nguyen Minh Nhung, Ho Xuan Anh Vu, Tran Thi Van Thi (2019), Preliminary study of the antioxidant properties of Ophiocordyceps sobolifera , IAJPS 2019, 06 (05), 10111-10116 (ISSN 2349-7750).
2. Thi Van Thi Tran; Van Khoa Tran; Xuan Anh Vu Ho; Lam Son Le; Trung
Hieu Le; Thi Hong Chuong Nguyen; Chinh Chien Nguyen; Soo Young Kim, Quyet Van Le (2021), Chemical structure of a novel heteroglycan polysaccharide isolated from the biomass of Ophiocordyceps sobolifera , Journal Of Molecular Structure 1232 (2021): 129986 (Q2, IF: 2.600).
* Tạp chí trong nước
3. Trần Văn Khoa, Lê Trung Hiếu, Lâm Lê Sơn, Trịnh Tam Kiệt, Trần Thị
Văn Thi (2019), Extraction optimisation of Ophiocordyceps sobolifera
polysaccharides with antoxidant activities, Tạp chí Hố học, 57(4E3,4), pp. 313-318.
4. Khoa Van Tran, Hieu Trung Le, Son Lam Le, Vu Xuan Anh Ho, Kiet Tam
Trinh, Thi Thi Van Tran (2019), Effect of extraction temperatures on in vitro
antioxidant activities of polysaccharides from Ophiocordyceps sobolifera , Hue University Journal of Science: Natural Science Vol. 128, No 1D.
5. Trần Văn Khoa, Lê Trung Hiếu, Trần Thanh Minh, Hồ Xuân Anh Vũ, Trần
Thị Văn Thi (2020), Ảnh hưởng của hệ dung môi chiết đến hàm lượng tổng các hợp chất phenol, tổng flavonoid và hoạt tính chống oxy hố của cao chiết từ nấm
Ophiocordyceps sobolifera . Tạp chí Khoa học và Cơng nghệ Trường Đại học Khoa học Huế. Tập 17, số 2, trang 11 – 23.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
[1]. Trịnh Tam Kiệt (2011). Nấm lớn ở Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
[2]. Trịnh Tam Kiệt (2012). Nấm lớn ở Việt Nam, NXB Khoa học Tự nhiên và Công nghệ.
Tiếng Anh
[3]. Adeneye A.A., Benebo A.S. (2008). Protective effect of the aqueous leaf and seed extract of Phyllanthus amarus on gentamicin and acetaminophen-induced nephrotoxic rats. Journal of Ethnopharmacology, Vol.118, Iss.2, pp.318–323. [4]. Agrawal P.K. (1992). NMR spectroscopy in the structural elucidation of
oligosaccharides and glycosides. Phytochemistry, Vol.31, Iss.10, pp.3307–
3330.
[5]. Ahmida M.H.S. (2012). Protective role of curcumin in nephrotoxic oxidative damage induced by vancomycin in rats. Experimental and Toxicologic Pathology, Vol.64, Iss.3, pp.149–153.
[6]. Al-Jaber N.A., Awaad A.S., Moses J.E. (2011). Review on some antioxidant plants growing in Arab world. Journal of Saudi Chemical Society, Vol.15,
Iss.4, pp.293–307.
[7]. Alam Z., Muyibi S.A., Toramae J. (2007). Statistical optimization of adsorption processes for removal of 2,4-dichlorophenol by activated carbon derived from oil palm empty fruit bunches. Journal of Environmental Sciences, Vol.19, Iss.6, pp.674–677.
[8]. Arantes-Rodrigues R., Colaỗo A., Pinto-Leite R., et al. (2013). In Vitro and In Vivo experimental models as tools to investigate the efficacy of antineoplastic drugs on urinary bladder cancer. Anticancer Research, Vol.33, Iss.4, pp.1273–1296.
[9]. Arany I., Safirstein R.L. (2003). Cisplatin nephrotoxicity. Seminars in Nephrology, Vol.23, Iss.5, pp.460–464.
[10]. Asnaashari M., Farhoosh R., Sharif A. (2014). Antioxidant activity of gallic acid and methyl gallate in triacylglycerols of Kilka fish oil and its oil-in-water emulsion. Food Chemistry, Vol.159, pp.439–444.
[11]. Bezerra M.A., Santelli R.E., Oliveira E.P., et al. (2008). Response surface methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry. Talanta, Vol.76, Iss.5, pp.965–977.
[12]. Bouaziz M., Grayer R.J., Simmonds M.S.J., et al. (2005). Identification and antioxidant potential of flavonoids and low molecular weight phenols in olive cultivar Chemlali growing in Tunisia. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, Iss.2, pp.236–241.
[13]. Cai Y., Luo Q., Sun M., et al. (2004). Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer. Life Sciences, Vol.74, Iss.17, pp.2157–2184.
[14]. Van Calsteren M.-R., Gagnon F., Nishimura J., et al. (2015). Structure determination of the neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus OLL1073R-1. Carbohydrate Research, Vol.413, pp.115–122.
[15]. Cekmen M, Iibey YO, Ozbek E, Simsek A, Somay A E.C. Cucurmin prevents oxidative renal damage induced by acetaminophen in rats. Food and Chemical
Toxicology, Vol.47(7), (n.d.) pp.1480- 1484.
[16]. Cheong K.L., Meng L.Z., Chen X.Q., et al. (2016). Structural elucidation, chain conformation and immuno-modulatory activity of glucogalactomannan from cultured Cordyceps sinensis fungus UM01. Journal of Functional Foods,
Vol.25, pp.174–185.
[17]. Chiu C.-H., Chyau C.-C., Chen C.-C., et al. (2014). Polysaccharide extract of
Cordyceps sobolifera attenuates renal injury in endotoxemic rats. Food and
Chemical Toxicology, Vol.69, pp.281–288.
[18]. Choi J.G., Kang O.H., Lee Y.S., et al. (2009). Antibacterial activity of methyl gallate isolated from galla rhois or carvacrol combined with nalidixic acid against nalidixic acid resistant bacteria. Molecules, Vol.14, Iss.5, pp.1773–1780.
[19]. Choi J.N., Kim J., Lee M.Y., et al. (2010). Metabolomics revealed novel isoflavones and optimal cultivation time of Cordyceps militaris fermentation.
[20]. Chyau C.-C., Chen C.-C., Chen J.-C., et al. (2014). Mycelia glycoproteins from
Cordyceps sobolifera ameliorate cyclosporine-induced renal tubule dysfunction in
rats. Journal of Ethnopharmacology, Vol.153, Iss.3, pp.650–658.
[21]. Cunningham K.G., Manson W., Spring F.S., et al. (1950). Cordycepin, a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.) Link.
Nature, Vol.166, Iss.4231, pp.949.
[22]. Dai J., Mumper R.J. (2010). Plant phenolics: Extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules, Vol.15, Iss.10, pp.7313–7352. [23]. Dasari S., Tchounwou P.B. (2014). Cisplatin in cancer therapy: molecular
mechanisms of action. European Journal of Pharmacology, Vol.740, pp.364–378. [24]. Dong C.-H., Yao Y.-J. (2008). In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis. LWT-Food Science and Technology, Vol.41, Iss.4, pp.669–677.
[25]. Dong H., Yang X., He J., et al. (2017). Enhanced antioxidant activity, antibacterial activity and hypoglycemic effect of luteolin by complexation with manganese(II) and its inhibition kinetics on xanthine oxidase. RSC Advances, Vol.7, Iss.84, pp.53385–53395.
[26]. Donika lvanova, Zhivko Zhelev, Ichio Aoki, Rumiana Bakalova T. (2016). Overproduction of reactive oxygen species - obligatory or not for induction of apoptosis by anticancer drugs. Chinese Journal of Cancer Reasearch,
Vol.28(4):, pp.383–396.
[27]. Dworecka-Kaszak B. (2014). Cordyceps fungi as natural killers, new hopes for medicine and biological control factors. Annals of Parasitology, Vol.60, Iss.3, pp.151–158.
[28]. Erdem A, Gündoğan NU, Usubỹtỹn A, Kilinỗ K , Erdem SR , Kara A B.A. (2000). The prrotective effect of taurine against gentamicin-induced acute tubular necrosis in rats. Nephrology Daialysis Transplantation, Vol.5(8),
pp.1175–1182.
[29]. Feng K.J., Cheng M.J., Yang S.S., et al. (2019). Chemical Constituents of the Endophytic Fungus Ophiocordyceps sobolifera . Chemistry of Natural Compounds, Vol.55, Iss.2, pp.309–312.
[30]. Ferreira S.L.C., Bruns R.E., Ferreira H.S., et al. (2007). Box-Behnken design: