Hình 1.5. Tổn thƣơng gan do sán lá gan lớn trên siêu âm
(Nguồn: www.benhgiunsan.com)
Chẩn đoán miễn dịch [29]: Kỹ thuật miễn dịch có ƣu điểm là có thể chẩn đốn nhiễm SLGL trong tất cả các giai đoạn của bệnh, đặc biệt trong giai đoạn cấp tính. Kỹ thuật miễn dịch thƣờng đƣợc sử dụng nhất là ELISA.
Xét nghiệm phân [29]: Các xét nghiệm phân từ xét nghiệm trực tiếp đến tập
trung trứng bằng các cách khác nhau đã đƣợc sử dụng trong chẩn đoán bệnh sán lá gan ở ngƣời. Kỹ thuật làm lắng để tìm trứng đƣợc chứng minh là ƣu điểm hơn các phƣơng pháp khác. Cần xét nghiệm phân trong 3 ngày liên tiếp. Chúng ta cũng có thể lấy dịch mật để phát hiện sự có mặt của trứng.
1.7. Tính đa dạng di truyền của Fasciola spp.
1.7.1. Các yếu tố tác động đến đa dạng di truyền của Fasciola spp.
Sinh học phân tử có ảnh hƣởng sâu sắc trong hầu hết các lĩnh vực nghiên cứu sinh học. Đến nay, trên thế giới các kỹ thuật của sinh học phân tử đã đƣợc áp dụng trong các nghiên cứu về Fasciola spp. với mức độ khác nhau. Một số
nghiên cứu đã sử dụng các kỹ thuật của sinh học phân tử để sản xuất ra protein của Fasciola spp. nhằm mục đích tạo vacxin phịng chống bệnh do Fasciola spp. gây ra ở động vật và ở ngƣời. Một số nghiên cứu khác lại sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để xác định đƣợc trình tự chuỗi ADN nhằm tìm hiểu tính đa dạng di truyền của Fasciola spp. [29].
Tính đa dạng di truyền trong một loài là nguyên liệu cơ bản để đánh giá tác động của mơi trƣờng đến q trình tiến hóa của lồi sinh vật đó. Vì thế, nghiên cứu tính đa dạng di truyền rất cần thiết cho q trình nghiên cứu tiến hóa của sinh vật.
Fasciola spp. là một ký sinh trùng đƣợc tìm thấy ở cả động vật có vú và động vật
thân mềm. Trong thời gian ký sinh, ở các động vật có vú khác nhau có thể có sự khác biệt lớn về mơi trƣờng sống. Vị trí ký sinh của Fasciola spp. trong q trình ký sinh cũng có thể thay đổi và ở các vị trí khác nhau trong cơ thể vật chủ và có những đặc điểm mơi trƣờng cũng rất khác nhau (bình thƣờng ở động vật nhai lại Fasciola
spp. ký sinh ở đƣờng tiêu hóa, khoang phúc mạc và nhu mơ gan). Bên cạnh đó, ấu
trùng lơng (miracidium) trong q trình di chuyển tự do có thể ở trong các điều kiện mơi trƣờng hồn tồn khác nhau trƣớc khi tìm và lây nhiễm sang ốc. Khi vào trong ốc tạo các nang ấu trùng (sporocysts), lúc này chúng lại phải chịu những tác động mới của môi trƣờng bên trong ốc. Những yếu tố này tác động đến tính đa dạng di truyền theo mỗi khu vực địa lý và tạo cho Fasciola spp. có những đặc điểm riêng, bao gồm cả sức đề kháng của Fasciola [29].
Theo Dalton (1999), cơ chế tạo nên sự đa dạng ở Fasciola spp. có thể xuất hiện tƣơng tự nhƣ những loài sinh vật khác, nhƣng lại có một số điểm khác thƣờng có thể ảnh hƣởng đến sự phát sinh tính đa dạng. SLGL là sinh vật lƣỡng tính, khả năng duy trì quần thể nơi chúng sống là rất lớn. Ở đây, ký sinh trùng phân chia mạnh nhƣng trong hồn cảnh đó thì xu hƣớng di truyền quần thể đồng nhất đi kèm. Điều này sẽ làm phong phú thêm sản phẩm của ấu trùng rediae sau giai đoạn phân chia vơ tính trong ốc (hiện tƣợng đa phơi). Một ấu trùng lơng có thể tăng sinh thành 600 ấu trùng đi. Sự phân chia ấu trùng rediae, tính trạng lƣỡng tính, tính đa phơi và nhu cầu trong vòng đời của ký sinh trùng đan xen giữa 2 vật chủ để có thể giảm tính đa dạng di truyền. Tuy nhiên, các yếu tố đó khơng làm ảnh hƣởng đến những tác động chọn lọc tạo ra các quần thể đa dạng di truyền. Những tác động chọn lọc có thể đƣợc chia làm 2 nhóm:
- Nơi cƣ trú ở thú ni: Ở Fasciola, nếu hạn chế đƣợc các lồi vật chủ trong giai đoạn phát triển vịng đời của nó thì có thể đƣợc coi là những thuận lợi cho quá trình lây truyền mầm bệnh.
- Hệ thống miễn dịch của vật chủ: Cả vật chủ trung gian và vật chủ chính có các hệ thống miễn dịch nhằm hạn chế quá trình lấy nhiễm. Trong các quần thể có quan hệ xa lạ, ở đó sẽ có những biến đổi có hiệu quả cho những đáp ứng này.
1.7.2. Vai trò của việc xác định lồi và phân tích đa hình sán lá gan lớn
Năm 1995, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) thông báo phát hiện bệnh SLGL ở 65 quốc gia và vùng lãnh thổ với gần 180 triệu dân nằm trong vùng nguy cơ và có khoảng 2,4 triệu ngƣời dân nhiễm bệnh [70]. WHO coi đây là bệnh cần đƣợc quan tâm trong chƣơng trình sức khỏe cộng đồng và đã đƣợc nhiều quốc gia xếp vào vị trí quan trọng trong chiến lƣợc và chính sách y tế.
Bệnh SLGL (Fascioliasis) có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho cơ thể ngƣời bệnh cả về thể chất lẫn tinh thần nếu khơng đƣợc chẩn đốn và điều trị sớm, đúng cách. Bên cạnh đó, trong trƣờng hợp sán di chuyển lạc chỗ có thể gây ra những dấu hiệu lâm sàng rất khó chẩn đốn và dễ nhầm với các bệnh lý khác. Những lí do trên là nguyên nhân gây tổn thất rất lớn về sức khỏe cũng nhƣ kinh tế cho gia đình và xã hội.
Phƣơng pháp sinh học phân tử mà cụ thể là phƣơng pháp PCR từ khi ra đời đã tỏ ra ƣu việt trong chẩn đoán và phân loại bệnh tật liên quan đến vi ký sinh. Nhờ phƣơng pháp này ngƣời ta có thể chẩn đốn chính xác tác nhân gây bệnh từ rất sớm, ngay cả khi bệnh tiềm tàng chƣa biểu hiện triệu chứng. Điều này giúp cho các nhà điều trị lựa chọn các biện pháp thích hợp, hiệu quả, ít tốn kém, góp phần ngăn chặn những hậu quả mà bệnh gây ra.
Bên cạnh hỗ trợ chẩn đốn sớm căn ngun gây bệnh, phƣơng pháp PCR cịn có thể xác định đƣợc cấu trúc gen của sinh vật, qua đó giúp các nhà khoa học xác định đƣợc sản phẩm do gen đó tạo ra. Trên cơ sở đó định hƣớng sản xuất kháng nguyên đặc hiệu sử dụng cho phƣơng pháp chẩn đoán miễn dịch học [17].
SLGL Việt Nam đƣợc xác định là F. gigantica có mặt ở cả 3 miền: Bắc,
Trung và Nam. Các dữ liệu về hệ gen ty thể cũng nhƣ hệ gen nhân của SLGL Việt Nam còn rất hạn chế. Chính vì vậy, việc xác định lồi và phân tích một phần gen của Fasciola spp. gây bệnh từ các vùng địa lý sẽ góp phần nghiên cứu ký sinh
trùng ở Việt Nam dƣới góc độ phân tử. Qua đó có cơ sở tìm hiểu cơ chế bệnh sinh, sản xuất các kít chẩn đốn huyết thanh, nghiên cứu các loại thuốc, tình trạng kháng thuốc, vacxin giúp cho q trình phát hiện, phịng chống bệnh này một cách có hiệu quả.
1.8. Các phƣơng pháp xác định loài sán lá gan lớn 1.8.1. Phƣơng pháp hình thái 1.8.1. Phƣơng pháp hình thái
Nhiều tác giả cho rằng, hình thể của F. gigantica và F. hepatica có nhiều
điểm khác nhau. Điểm khác biệt dễ thấy nhất là F. gigantica có kích thƣớc dài hơn, trong khi F. hepatica có kích thƣớc ngắn hơn. Theo một số tác giả, dựa vào một số chỉ số hình thái có thể xác định và phân biệt các loài SLGL. Các chỉ số cơ thể thƣờng đƣợc sử dụng là chỉ số khối cơ thể (BR), kích thƣớc chiều dài và chiều rộng thân, tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng thân sán (BL/BW), giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn và khoảng cách từ giác bụng đến cuối thân (VS-P). Theo một nghiên cứu của Periago và CS (2006), kết quả ở bảng sau [59]:
Chỉ số (mm) F. hepatica F. gigantica
BR 1,06 – 1,58 1,71 – 3,65 BL/BW 1,29 – 2,80 3,40 – 6,78
VS-P 8,86 – 25,08 26,28 – 50,09
Tuy nhiên các chỉ số này thay đổi phụ thuộc SLGL vào vật chủ ký sinh nào, khu vực nghiên cứu nào… Một số nghiên cứu cho thấy, các chỉ số BR, BL/BW và VS-P có sự khác biệt căn bản giữa F. hepatica và F. gigantica. Một số khác lại cho thấy các chỉ số này có một phần gối lên nhau. Chính điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc xác định lồi sán bằng hình thái học.
1.8.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
1.8.2.1. Đặc điểm, vai trò hệ gen ty thể và hệ gen nhân trong giám định loài
Hiện nay hệ gen ty thể đƣợc sử dụng phổ biến để nghiên cứu về di truyền ở giun sán trong nghiên cứu phả hệ phân tử, xác định hệ thống phân loại và dịch tễ học [16]. Các quần thể giun sán có khả năng đáp ứng với các tác động mơi trƣờng và có q trình chọn lọc tự nhiên, vì vậy khơng bắt buộc phải đồng nhất về mặt di truyền. Việc sử dụng các phƣơng pháp truyền thống để tìm ra những thay đổi qua đó xác định bằng chứng tiến hóa của một lồi nào đó nói chung khó thành cơng. Sử dụng hệ gen ty thể có ƣu điểm và đƣợc sử dụng nhiều hơn hệ gen nhân trong việc cung cấp những thơng tin về bằng chứng tiến hóa của sinh vật [16].
Đặc điểm hệ gen nhân ribosomal DNA (rDNA)
Vùng gen ribosome (rDNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có nhiều bản sao và khơng mã hóa cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tƣơng đồng và khác biệt của các sinh vật cùng lồi hay khác lồi, đóng vai trị quan trong trong các nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh lồi và phát hiện hiện tƣợng lai giữa các loài.
Vùng gen rDNA chứa 5' external transcribed sequence (5' ETS), 18S rRNA, ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 28S rRNA và 3' ETS. Gen ITS-1 và ITS-2 (internal transcribed spacer 1 and 2) với hai đầu biên là IGS (intergenic spacer là vùng kém
bảo tồn nhất của rDNA) (Hình 1.6). Vùng 5,8S – rDNA là vùng có kích thƣớc rất nhỏ và ít có sự biến đổi [62]. Vùng ITS - rDNA là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thƣờng để xác định các biệt hóa trong cùng lồi để lập phả hệ di truyền [36]. Các primer thiết kế trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất các sinh vật cùng loài nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh, tạo phả hệ di truyền. Ngoài ra nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh sinh vật [67].
Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc ribosome ADN của gen nhân [17]
Đặc điểm hệ gen ADN ty thể
ADN ty thể quy định tính di truyền theo dịng mẹ, có kích thƣớc khoảng 16 - 30 kb, bao gồm 36 - 37 gen mã hóa cho sản phẩm protein và một số vùng khơng mã hóa cần thiết cho sự sao chép và phiên mã [43].
Ngồi các gen mã hóa protein, hệ gen ty thể ký sinh trùng và động vật cịn có 2 gen RNA ribosome (rRNA) là 12S rRNA (hay rrnS) và 16S rRNA (hay rrnL), 22 gen RNA vận chuyển (tRNA) và một vùng không gen không mã hóa protein, có độ dài ngắn phụ thuộc vào từng lồi động vật [26, 39, 43].
Với vị trí nằm trong tế bào chất, số lƣợng bản sao nhiều của ADN ty thể quy định những đặc điểm di truyền của ty thể [29], đó là: Di truyền theo dịng mẹ; tỷ lệ đột biến cao hơn hệ gen nhân; sao chép độc lập với quá trình phân bào; tác động
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (IGS)
Internal transcribed spacer (ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S 5.8S 18S
ITS-1
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-1 28S 18S 5.8S 2 28S 18S Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-2 -1 28S 28S 5.8S ITS-2 28S ITS-1 18S
Vùng gen cần giải trình tự trong nghiên cứu
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (IGS)
Internal transcribed spacer (ITS)
External transcribed spacer (ETS)
18S 5.8S 18S
ITS-1
28S 18S 5.8S 2 28S 18S
Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-1 28S 18S 5.8S 2 28S 18S Intergenicspacer (
Internal transcribed spacer (ITS) ) 18S 5.8S 18S ITS-2 -1 28S 28S 5.8S ITS-2 28S ITS-1 18S ITS-1 5.8S ITS-2 28S28S28S 18S ITS-1 5.8S ITS-2 28S28S28S 18S
ngƣỡng: để biểu hiện một bệnh cần đòi hỏi ADN bị đột biến phải vƣợt qua một ngƣỡng nào đó; các đột biến ADN ty thể ở tế bào sơma có liên quan đến tuổi tác.
Những ƣu điểm của hệ gen ty thể
Kích thƣớc hệ gen ty thể nhỏ hơn so với hệ gen nhân tế bào, chứa đầy đủ các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên DNA ty thể đƣợc coi là đối tƣợng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen về chẩn đoán, giám định, phân loại, dịch tễ học và di truyền quần thể [43, 26].
Gen ty thể trong cùng lồi hoặc có quan hệ dƣới lồi sinh học có tính bảo thủ rất cao nên bất kỳ sự thay đổi nhỏ nào cũng là giá trị đƣợc phản ánh trong giám định, phân loại và nghiên cứu di truyền học [33].
Hệ gen ty thể cung cấp nguồn dữ liệu quý giá về chỉ thị phân tử trong nghiên cứu về mối quan hệ giữa các loài và nội bộ loài trong giám định phả hệ và dịch tễ học [71].
Ngoài ra, sự hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể của ký sinh trùng cịn có giá trị lớn trong chẩn đốn và phịng chống bệnh nhằm tìm kiếm các loại hóa chất, hóa dƣợc đặc hiệu trong phòng và điều trị bệnh hoặc kiến tạo các loại vaccin thế hệ mới [43, 39]. Đã có nhiều hệ gen ty thể của các loại ký sinh trùng nhƣ giun đũa (Ascaris
suum), giun chỉ (Onchocerca), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F. gigantica), sán
lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini)… đƣợc giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký sinh trùng [17].
Tính đến năm 1999, chƣa có hệ gen ty thể hồn chỉnh nào của sán dẹt đƣợc thông báo và đăng ký. Chỉ sau đó chừng 2 năm, một loạt hệ gen ty thể hoàn chỉnh và gần hồn chỉnh đã đƣợc cơng bố, trong đó có 6 hệ gen ty thể của sán dẹt (5 của sán dây và 1 của sán lá) [17]. Đến nay, đã có rất nhiều hệ gen ty thể hoàn chỉnh hoặc khá hoàn chỉnh của sán lá, sán dây gây bệnh ở ngƣời và động vật đƣợc công bố nhƣ Paragonimus westermani, Schistosoma mansoni, S japonicum, S. spindale,
Taenia crassiceps,T. solium, T. asiatica và T. saginata [17].
Hệ gen ty thể của sán dẹt có cấu trúc và cách sắp xếp tƣơng đối khác so với các động vật đa bào, đặc biệt về chiều dài, thành phần gen, hoặc cấu trúc của ARN vận chuyển và ARN ribosome. Sán dẹt cũng giống giun trịn và một số ít động vật
đa bào khác là khơng có gen atp8. Trong tất cả các hệ gen ty thể của động vật đa bào đƣợc nghiên cứu cho đến nay thì hệ gen ty thể của sán dây (T. crassiceps, T.
asiatica, T. solium) là nhỏ nhất (khoảng 13,5-13,7) [17].
Ở động vật nói chung và ở sán dẹt nói riêng, trật tự gen ty thể thƣờng có tính ổn định trong một thời gian dài của q trình tiến hóa. Sự khác nhau về trật tự gen giữa các thành viên trong cùng một họ rất hiếm, sự khác biệt đáng kể chỉ xảy ra ở mức phân loài lai nhƣ lớp hoặc ngành.
Hệ gen ty thể của động vật có xƣơng sống giàu AT (AT rich) thƣờng chiếm ƣu thế. Đặc điểm này cũng đƣợc ghi nhận ở các gen mã hóa protein ở một số sán dẹt ký sinh. Tuy nhiên, có sự khơng đồng nhất giữa các lồi. Ví dụ, ở sán dây T. crassiceps và tất cả các loài sán máng khác tỷ lệ AT trên 70% (ngoại trừ S. mansoni 68,7%). Ở sán lá gan lớn F. hepatica là 63,5% và ở sán lá phổi P.