Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu
SLGL trƣởng thành thu thập từ ngƣời và động vật Làm tiêu bản Chụp ảnh, đo đạc các chỉ số Tách ADN tổng số Nhận xét hình thể; so sánh hình thái SLGL nghiên cứu
với SLGL trên thế giới
Chạy PCR
Điện di kiểm tra trên gel agarose 2%
Chọn mẫu để tinh sạch ADN phục vụ giải trình tự
Giải trình tự trên máy tự động
Thu trình tự, phân tích trình tự thu đƣợc với trình tự chuẩn
Đối chiếu, so sánh kết quả phân tích hình thái và trình tự
gen
2.4.2. Cỡ mẫu phân tích
Cỡ mẫu theo nghiên cứu thống kê có ý nghĩa với n ≥ 30. Do đó, chúng tơi lựa chọn nghiên cứu tối thiểu 30 mẫu ở mỗi tỉnh. Tổng số mẫu nghiên cứu ở 5 tỉnh là 150 mẫu.
2.4.3. Phƣơng pháp xác định kích thƣớc các chỉ số hình thái
Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng sán thu đƣợc từ phân ngƣời và dịch mật từ túi mật của buồng gan động vật tại các điểm nghiên cứu. Con sán trƣởng thành và trứng đƣợc ngâm trong nƣớc muối sinh lý (NaCl 0,9%).
Kỹ thuật làm tiêu bản cố định mẫu SLGL trƣởng thành
Thu thập SLGL trƣởng thành và trứng từ bệnh nhân và lò mổ ở các điểm nghiên cứu. Các cá thể sán lá và trứng thu đƣợc sẽ đƣợc rửa chung trong nƣớc muối sinh lí (NaCl 0,9%) 3-4 giờ để đẻ bớt trứng.
Đặt sán lên lam kính sạch cố định bằng cồn 70°, phủ lá kính, cuốn chỉ và định hình trong cồn 70° trong 2 tuần trƣớc khi nhuộm.
Sán lá gan sau khi đƣợc cố định trong cồn 70° và thuốc nhuộm 15 – 30 phút cho đế nkhi có màu mận chín thì bỏ sán vào cồn axit.
Để mẫu SLGL trong cồn axit từ vài giây đến 5 phút cho đến khi sán có màu hồng. Quan sát bằng kính lúp để xác định xem các bộ phận bên trong sán đã rõ thì thơi. Nếu chƣa rõ thì phải để lại vào thuốc nhuộm.
Làm trong: từ cồn axit chuyển sán lần lƣợt sang cồn 80° rồi 90° - 96° từ 10 – 15 phút đối với mỗi loại cồn. Sau đó để giữ sán trong dung dịch xylen.
Gắn gơm, đặt lá kính lên sán (tùy theo độ dày của sán) để gắn chặt sán giữa lam và lá kính.
Sau đó đƣợc định loại bằng dấu hiệu hình thái đến giống hoặc lồi theo khóa định loại và mơ tả có sẵn của Urquhart (1996) và bảo quản trong cồn ethanol 70% cho tới khi tách chiết ADN tổng số [63].
Dựa vào khóa phân loại, căn cứ vào hình thái và kích thƣớc chiều dài, chiều rộng thân, giác miệng, giác bụng, buồng trứng, tinh hoàn của con SLGL đƣợc xác định thuộc loài F. gigantica (Cobbold, 1885), F. hepatica, giống Fasciola
(Linnaeus, 1785), họ Fasciolidae (Railliet, 1895), bộ Fasciolida (Skrjabin et Schulz, 1937).
Dựa vào khóa định loại hình thể trứng SLGL theo Skrjabin và CS (1977) và Nguyễn Thị Lê và CS (1996).
Các chỉ số hình thể SLGL trong nghiên cứu này bao gồm: Chiều dài (BL), chiều rộng (BW), kích thƣớc giác bụng (VS), kích thƣớc giác miệng (OS), chiều rộng cổ sán (CW), chiều dài đầu sán (CL), khoảng rộng tinh hoàn (TW), khoảng độ dài tinh hoàn (TL), khoảng cách giác bụng đến cuối thân (VS – P), khoảng cách từ giao điểm của tuyến hoàng thể đến cuối thân (Vit – P).
Kỹ thuật xét nghiệm phân lắng cặn tìm trứng sán
Phƣơng pháp xét nghiệm phân lắng cặn đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc miêu tả bởi Ash và Orihel (1987).
2.4.4. Các phƣơng pháp định loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.4.1. Tiến hành phản ứng PCR-RFLP
Tách chiết ADN: Mẫu sán đƣợc tách chiết bằng DNeasy kit của hãng
QIAgen, Mỹ theo quy trình của nhà sản xuất. Sản phẩm ADN sau tách chiết sẽ đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi dùng.
Cách tiến hành đƣợc tóm tắt nhƣ sau:
Bƣớc 1: Ngâm mẫu trong PBS để loại bỏ cồn. Cắt một mẩu sán (khoảng 25 mg) hoặc sử dụng mẫu trứng sán thu từ ngƣời hoặc động vật.
Bƣớc 2: Mẫu SLGL đƣợc cho vào cối đá chuyên dụng và nghiền cùng với nitơ lỏng bằng chày chuyên dụng.
Bƣớc 3: Lấy bột thu đƣợc cho vào eppendorf 1,5ml và thêm 180µl dung dịch ATL (ATL buffer) vào.
Bƣớc 4: Thêm 20µl proteinase K, trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ 56oC trong 5 giờ.
Bƣớc 5: Ly tâm ống chứa mẫu trong thời gian ngắn để làm những giọt nƣớc từ trên nắp bên trong tube rơi xuống.
Bƣớc 6: Thêm 200µl đệm AL, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây, rồi ủ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút.
Bƣớc 7: Ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 giây.
Bƣớc 8: Thêm 200µl ethanol (96-100%) vào mẫu, trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây.
Bƣớc 9: Ly tâm 8000 vòng/phút trong thời gian ngắn.
Bƣớc 10: Cẩn thận chuyển hỗn dịch thu đƣợc ở bƣớc trên (bao gồm cả cặn) vào cột lọc sao cho không ƣớt ống.
Bƣớc 11: Đóng nắp và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút. Đặt cột lọc trong một ống thu mẫu sạch loại 2ml và loại bỏ ống chứa phần nƣớc vừa lọc.
Bƣớc 12: Cẩn thận mở nắp cột lọc và thêm 500µl đệm AW1, để 1 phút ở nhiệt độ phịng. Đóng nắp, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút và loại bỏ cặn vừa ly tâm.
Bƣớc 13: Cẩn thận mở nắp cột lọc và cho vào đó 500µl AW2 để 1 phút ở nhiệt độ phịng. Đóng nắp và ly tâm 8000 vịng/phút x 1 phút. Sau đó ly tâm ở tốc độ tối đa 14000 vòng/phút trong 3 phút. Đặt cột lọc trong một ống ly tâm sạch loại 1,5ml và loại bỏ ống chứa dịch và ly tâm.
Bƣớc 14: Cẩn thận mở nắp ống và thêm 200µl đệm AE hoặc nƣớc siêu sạch. Bƣớc 15: Ủ ở nhiệt độ phòng thời gian 3-5 phút, sau đó ly tâm 14000 vịng/phút, bảo quản ADN ở -20oC.
Thực hiện kỹ thuật PCR-RFLP gồm 2 bƣớc: Bƣớc 1 thực hiện phản ứng
PCR; bƣớc 2 sử dụng enzyme giới hạn cắt sản phẩm PCR vừa đƣợc nhân bản. Bƣớc 1: Thực hiện phản ứng PCR để nhân bản đoạn ITS-2. Cặp mồi đƣợc thiết kế theo Mahami Oskouei và CS (2011) [47]. Trình tự mồi BD1: 5’ GTC GTA ACA AGG TTT CCG TA 3’ và mồi ngƣợc. Trình tự mồi BD2: 5’ TAT GCT TAA ATT CAG CGG GT 3’ và mồi ngƣợc, có kích thƣớc khoảng 1000 bp. Chu kỳ nhiệt là 950C/5 phút, tiếp theo 30 chu kỳ với 950C/30 giây, 61,60C/30giây, 720C/30 giây, chu kỳ cuối kéo dài 720C/7 phút. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 2% trong dung dịch đệm TBE 0,5X. Nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1g/ml) 30 phút. Sau đó kiểm tra và chụp ảnh bằng hệ thống BioDocgel.
Bƣớc 2: Sử dụng enzyme giới hạn Tsp509I cắt sản phẩm PCR vừa nhân bản ở bƣớc 1. Thành phần phản ứng: 2 µl Fast digest buffer, 1 µl Tsp509I, 7 µl H2O, 5 µl ITS2-ADN. Điều kiện phản ứng: 65°C trong 10 phút.
Sản phẩm chạy điện di trên gel agarose 3% trong dung dịch TBE 0,5X, ở 25 volt trong 15 phút, rồi đƣa lên 50 volt trong 20 phút. Kiểm tra và chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh BioDocgel.
Kết quả chạy PCR đƣợc phân tích kích thƣớc trên thang chuẩn (100bp) do nhà phân phối cung cấp.
Bảng 2.1. Kết quả dự đoán sản phẩm ADN bằng các kỹ thuật PCR và PCR - RFLP
Tên loài
Sản phẩm nhân bản ITS-2 sau khi chạy
phản ứng PCR
Sản phẩm phản ứng cắt bằng
Tsp509I
F.hepatica 1000 bp 102, 171, 343 và 427 bp
F.gigantica 1000 bp 102, 171, 208, 219 và 343 bp
(thực tế ảnh chỉ nhìn thấy 4 băng tại các vị trí 102, 171, 213 và 343 bp)
F.hepatica/ F.gigantica
1000 bp 102, 171, 213, 343 và 427 bp
2.4.4.2. Giải trình tự gen
Sử dụng bộ kít tinh sạch ADN của hãng QIAgen. Sản phẩm PCR sau khi đƣợc tinh sạch đƣợc gửi đi giải trình tự gen tại cơng ty Cổ phần dịch vụ phân tích di truyền Gentis. Các mẫu đƣợc giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI3130. Trình tự gen đƣợc so sánh và đối chiếu với ngân hàng GENBANK. Xác định phả hệ dựa trên trình tự đoạn ADN bằng phần mềm Clustal W và MEGA6.