Loài sán Theo tỷ lệ BL/BW Theo VS-P n % n % F. hepatica-like 9 6 4 2,67 Fasciola sp.-like 51 34 9 6 F. gigantica-like 90 60 137 91,33
Theo tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán (Bảng 3.7) có 9 mẫu phù hợp với F.
hepatica, 51 mẫu phù hợp với Fasciola spp., 90 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Theo chỉ số VS-P, có 4 mẫu phù hợp với F. hepatica và 9 mẫu phù hợp với Fasciola spp., 137 mẫu phù hợp với F. gigantica.
Hình 3.3. So sánh sự phù hợp về loài sán theo tỷ lệ (%) BL/BW và VS-P
Nhƣ đã nói ở trên, trong số các chỉ số hình thái của SLGL, các chỉ số BL, BW, VS-P và BL/BW là các chỉ số quan trọng để phân loại SLGL về mặt hình thái. Theo Periago và CS (2006) (Phụ lục 2), chỉ số VS-P ở F. hepatica là 12,4 – 25,08 mm (trung bình 20,79 ± 0,31), ở F. gigantica là 31,01 – 45,39 mm (trung bình
41,02 ± 1,21); chỉ số BL/BW ở F. hepatica là 1,65 – 2,76 (trung bình 2,27 ± 0,03), ở F. gigantica là 3,45 – 5,5 (trung bình 4,37 ± 0,17). Trong nghiên cứu của chúng
6
34
60
Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số BL/BW (%)
F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like
2.67 6
91.33
Sự phù hợp về loài sán theo chỉ số VS-P (%)
F. hepatica-like Fasciola sp.-like F. gigantica-like
tôi, chỉ số VS-P đo đƣợc dao động từ 25 – 38 mm (trung bình 30,85±3,22) và BL/BW từ 2,33 – 4,94 (trung bình 3,43±0,49). Nhƣ vậy, theo tỷ lệ BL/BW có 9 mẫu phù hợp với F. hepatica, 51 mẫu phù hợp với Fasciola sp., 90 mẫu phù hợp
với F. gigantica; theo chỉ số VS-P, có 4 mẫu phù hợp với F. hepatica và 9 mẫu phù hợp với Fasciola sp., 137 mẫu phù hợp với F. gigantica. (Bảng 3.7).
Trƣớc đây, nhiều tác giả cho rằng ở Việt Nam có cả 2 lồi F. hepatica và F.
gigantica. Tuy nhiên, gần đây một số tác giả xác định loài SLGL trên trâu bò ở
Việt Nam là F. gigantica [18, 5]; đặc biệt là có sự tồn tại của một dạng trung gian là dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica trong quần thể SLGL tại Việt Nam
[16]. Kết quả của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) khi nghiên cứu SLGL trên quần thể dê tại Việt Nam cho thấy đa số SLGL có kích thƣớc tƣơng ứng với
F. gigantica (> 35 mm x 12 – 15 mm), một số cá thể có hình thái giống F. hepatica (20 – 25 mm x 12 – 15 mm) và một số ít có kích thƣớc chiều dài trung
gian (30 – 35 mm) [22]. Kết quả phân loại hình thái ở nghiên cứu này cũng chỉ ra lồi SLGL trên trâu bị ở 5 tỉnh miền Bắc Việt Nam là F. gigantica. Sự khác nhau giữa các kết quả có thể do việc phân loại dựa vào hình thái khó có thể xác định chính xác lồi, nhất là các lồi có họ hàng gần gũi do các lồi này có sự đa hình về hình thái [9, 29]. Đối với SLGL, kích thƣớc và hình dạng của SLGL có thể thay đổi phụ thuộc vào vật chủ ký sinh, số lƣợng sán nhiễm ở vật chủ và tình trạng dinh dƣỡng của vật chủ, thời gian thu thập mẫu trong năm… Do tính đa hình về hình thái của SLGL nên chỉ dựa vào hình thái rất khó có thể phân biệt F. hepatica hay
F. gigantica [29]. Trong một nghiên cứu của Ghavami và CS (2009) cho thấy,
trong 584 cá thể SLGL thu thập từ bị và cừu có 31 % số cá thể SLGL có hình thái giống F. hepatica, 7% giống F. gigantica và 62% giống Fasciola sp.; tuy nhiên,
khi chọn ngẫu nhiên một số mẫu từ cả 3 nhóm đem so sánh trình tự gen với các mẫu chuẩn lại cho kết quả đều là F. hepatica [35].
Hình 3.4. Một số hình ảnh con sán lá gan lớn
(Ký hiệu mẫu: NAS 02: Nghệ An sán 02, NAS 04: Nghệ An sán 04, NĐS 02: Nam Định sán 02, THS 03: Thanh Hóa sán 03, THS 02: Thanh Hóa sán 02, BGS 02: Bắc Giang sán
02, HNS 01: Hà Nội sán 01, HNS 02: Hà Nội sán 02)
Hình 3.5. Hình thể và kích thƣớc mẫu SLGL tại một số điểm nghiên cứu
(Ký hiệu mẫu: HNS 02: Hà Nội sán 02, THS 03: Thanh Hóa sán 03, NĐS 02: Nam Định sán 02)
Kết quả hình thái học con SLGL trƣởng thành đa số là Fasciola gigantica. Dựa vào tỷ lệ chiều dài/chiều rộng thân sán có 90 mẫu phù hợp với F. gigantica,
chiếm 60% tổng số sán định loại (150 mẫu). Theo chỉ số VS-P, có 137 mẫu phù hợp với F. gigantica, chiếm 91,33% tổng số sán định loại.
3.1.2. Các chỉ số trứng SLGL thu đƣợc trên động vật (vật kính 40x)
Trứng SLGL trên động vật thu từ dịch mật trong túi mật của buồng gan trâu bò tại các điểm nghiên cứu. Đa số trứng có dạng thon dài, màu nâu vàng nhạt, có một nắp ở đầu, đầu cịn lại có một gai nhỏ. Trứng SLGL đƣợc đếm số lƣợng, đo kích thƣớc chiều dài, chiều rộng và tính tỉ số chiều dài/chiều rộng.
(a) (b) (c) (d) Hình 3.6. Một số hình ảnh trứng sán lá gan lớn. Ảnh chụp trên vật kính 40x (hình a, b) và vật kính 10x (hình c, d), thƣớc đo = 10 µm Bảng 3.8. Các chỉ số kích thƣớc trứng thu trên động vật Tỉnh n
Chiều dài (µm) Chiều rộng (µm)
Min Max TB Min Max TB
Bắc Giang 30 152 184 166,6±8,76 89 114 100,4±6,88 Hà Nội 30 150 179 168,8±6,59 91 104 98,1±5,52 Nam Định 30 157 182 168,8±6,58 92 108 102,2±5,39 Nghệ An 30 165 182 174,3±4,76 93 112 100,2±6,42 Thanh Hóa 30 160 182 172,4±6,6 90 112 102,1±5,64 Tổng 150 150 184 170,2±7,2 89 114 100,6±6,1
Kết quả bảng 3.8 cho thấy chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm).
Bảng 3.9. Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng sán lá gan lớn thu trên động vật
Tỉnh n Tỷ số Dài/rộng Min Max TB Bắc Giang 30 1,4 2,06 1,66±0,13 Hà Nội 30 1,44 1,87 1,72±0,09 Nam Định 30 1,52 1,95 1,66±0,13 Nghệ An 30 1,5 1,89 1,75±0,12 Thanh Hóa 30 1,53 1,97 1,64±0,19 Tổng 150 1,4 2,06 1,69±0,12
Bảng 3.9 cho thấy tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
Hình 3.7. So sánh tỷ lệ chiều dài/chiều rộng của trứng SLGL thu trên động vật 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Bắc Giang Hà Nội Nam Định Nghệ An Thanh Hóa 1.4 1.44 1.52 1.5 1.53 2.06 1.87 1.95 1.89 1.97 Min Max
Tiến hành đo kích thƣớc 150 trứng SLGL thu đƣợc từ dịch mật của buồng gan trâu bò, kết quả cho thấy: Chiều dài của trứng SLGL dao động từ 150 µm đến 184 µm (trung bình 170,2±7,2 µm), chiều rộng dao động từ 89 µm đến 114 µm (trung bình 100,6±6,1 µm). Tỷ lệ chiều dài và chiều rộng của trứng SLGL dao động từ 1,4 đến 2,06 (trung bình 1,69±0,12).
Kích thƣớc trứng và tỷ lệ dài/rộng của trứng SLGL trong nghiên cứu này ở mức trung bình so với SLGL ở các nghiên cứu khác trong nƣớc và trên thế giới (Phụ lục 4). Nghiên cứu của Valero và CS (2009) tại Bolivia trên trâu bị cho kết quả kích thƣớc trứng F. hepatica có chiều dài dao động từ 105,3-155,9 µm (trung bình 132,0±10,5 µm), chiều rộng dao động từ 61,7-82,5 µm (71,14±4,3 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,6-2,3 (1,8±0,2); cịn kích thƣớc của trứng F. hepatica trên lợn có chiều dài là 73,8-148,6 µm (123,8±11,3 µm), chiều rộng là 58,1-82,6 µm (71,8±4,4 µm). Cũng theo tác giả này, F. gigantica tại Burkina Faso có chiều dài dao động từ
129,6-204,5 µm (156,8±1,1 µm), chiều rộng dao động từ 61,6-112,5 µm (89,4±0,7 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,1-2 (1,7±0,2) (Phụ lục 4). Theo Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) nghiên cứu tại Việt Nam cho kết quả chiều dài của Fasciola spp. trên ngƣời là 100-180 µm (152,5±1,75 µm), chiều rộng là 50-110 µm (79,39±1,43 µm), tỷ lệ dài/rộng là 1,4-2,6 (1,95±0,2) (Phụ lục 4). Nhƣ vậy, kích thƣớc trứng SLGL trong nghiên cứu này có kích thƣớc trung bình so với một số nghiên cứu khác tại Việt Nam, Hy Lạp, Iran, Ai Cập. Hầu hết trứng SLGL trong nghiên cứu này giống với trứng F. gigantica. Sự khác biệt này có thể do sự khác nhau của vật chủ mà sán ký sinh, mật độ sán nhiễm trong vật chủ…
3.2. Kết quả định loại bằng phƣơng pháp sinh học phân tử 3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR 3.2.1. Kết quả nhân đoạn gen ITS-2 bằng kỹ thuật PCR
Chúng tơi tiến hành phân tích 150 mẫu con sán lá gan lớn, 150 mẫu trứng sán ở trâu bò tại 5 tỉnh (Bắc Giang, Hà Nội, Nam Định, Nghệ An, Thanh Hóa) và 14 mẫu trứng sán thu từ phân ngƣời. Sau khi tiến hành nhân bản gen bằng phản ứng PCR thu đƣợc 314 mẫu (bao gồm 150 mẫu con sán trƣởng thành và 164 mẫu trứng sán) cho sản phẩm ADN với các băng có kích thƣớc bằng nhau 1.000 bp, đây là kết quả của giống Fasciola spp.
Hình 3.8. Kết quả nhân gen mẫu SLGL bằng phản ứng PCR
3.2.2. Kết quả PCR - RFLP
Tiến hành phản ứng PCR-RFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn Tsp509I đối
với các sản phẩm của phản ứng PCR, vì Tsp509I có thể tách riêng các lồi Fasciola
spp.. Enzyme này nhận biết chuỗi AATT trong ADN sợi đơi và cắt sau vị trí 0 trên
mỗi mạch [47].
Kết quả ở hình 3.8 cho thấy trong số 150 mẫu con sán lá gan lớn trƣởng thành, chúng tôi thu đƣợc 150 mẫu bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 213, 343 bp; khơng có mẫu nào bị cắt cho kết quả 4 băng ở các vị trí 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.10. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng BGS1
Hình 3.9 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu BGS1 có tín hiệu rõ nét.
Kết quả ở hình 3.10 cho thấy mẫu THT2 bị cắt cho kết quả 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 343, 427 bp.
Hình 3.12. Trình tự đoạn ADN thu đƣợc với trình tự mồi BD1 của mẫu trứng THT2
Hình 3.11 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 220 đến 270) của mẫu THT2 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 150 mẫu trứng sán thu từ dịch mật của buồng gan trâu bị có 01 mẫu thu tại Thanh Hóa khi cắt bằng enzyme Tsp509I cho kết quả 4 băng tƣơng ứng là: 102, 171, 343, 427 bp và 149 mẫu còn lại bị cắt cho 5 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là 102, 171, 208, 219, 343 bp; khơng có mẫu nào bị cắt cho 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp. Kết quả trên cho thấy mẫu trứng sán lá gan lớn thu tại Thanh Hóa là F. hepatica, 149 mẫu cịn lại là F. gigantica. Nhƣ vậy, đa số trâu bò tại 5 tỉnh miền Bắc nhiễm F. gigantica, một số ít trƣờng hợp nhiễm F. hepatica. Kết quả này trùng với kết quả của Lê Thanh Hòa (2007) [16], Nguyễn Thị Giang Thanh (2010) [22].
Hình 3.13. Sản phẩm PCR-RFLP của các mẫu sán cho kết quả F. gigantica/F.
hepatica (mẫu NA6)
Trong số 14 mẫu trứng sán trên ngƣời có 13 mẫu bị cắt cho 4 băng có kích thƣớc tƣơng ứng là: 102, 171, 213 và 343 bp và 01 mẫu bệnh nhân tại Nghệ An (mẫu NA6) sau khi bị cắt cho ra 5 băng tại các vị trí 102, 171, 213, 343 và 427 bp.
Hình 3.13 cho thấy trình tự đoạn ADN (minh họa đoạn từ 290 đến 340) của mẫu NA6 có tín hiệu rõ nét.
Trong số 314 mẫu phân tích có 312 mẫu sán và trứng sán là F. gigantica; 01 mẫu trứng sán trên trâu bị tại tỉnh Thanh Hóa là F. hepatica; 01 mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An là F. gigantica/ F. hepatica. Kết quả này cho thấy mẫu sán trên ngƣời có dạng lai F. gigantica và F. hepatica, lý do có thể đây là sự thích nghi của sán trên vật chủ ký sinh là ngƣời. Kết quả này giống với kết quả của Mahami Oskouei và CS (2011) [47], Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Thu Hƣơng và CS (2012) [20].
Trong kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) cho thấy điểm khác biệt trong việc sử dụng chỉ thị gen di truyền. Khi sử dụng chỉ thị gen
COX 1 (thuộc hệ gen ty thể), các gen không biến đổi và di truyền theo dòng mẹ là F. gigantica, trong khi đó nếu sử dụng chỉ thị ITS-2 (thuộc hệ gen nhân) đã xác định đƣợc loài mới là dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica [22]. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tơi đã đóng góp thêm bằng chứng về dạng lai giữa F. hepatica và F. gigantica trên vật chủ là ngƣời (tại tỉnh Nghệ An).
3.2.3. Kết quả so sánh sự sai khác, tỷ lệ tƣơng đồng của trình tự ITS-2
Chúng tơi tiến hành giải trình tự 01 mẫu sán trƣởng thành tại Bắc Giang (BGS1), 01 mẫu trứng trên trâu bò tại Thanh Hóa (THT2), 01 mẫu trứng trên ngƣời tại Nghệ An (NA6). Sau đó kết quả giải trình tự đƣợc Blast trên GENBANK để so sánh độ tƣơng đồng. Kết quả nhƣ sau:
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F.
hepatica của Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (Mũi tên chỉ vào các vị trí nucleotide sai khác)
Hình 3.15 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu trứng Thanh Hóa (THT2) sai khác 2 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Niger (AM900370.1), độ tƣơng
đồng 99 %.
Hình 3.16. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu THT2 (H5) với trình tự mẫu F.
gigantica của Niger (JN828955.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (Mũi tên chỉ vào các vị trí nucleotide sai khác)
Hình 3.16 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu trứng Thanh Hóa (THT2) sai khác 13 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (JN628955.1), độ tƣơng
đồng 99 %.
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F.
gigantica của Niger (AM900370.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (Mũi tên chỉ vào các vị trí nucleotide sai khác)
Hình 3.17 cho thấy trình tự ITS-2 của mẫu sán Bắc Giang (BGS1) sai khác 5 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (AM900370.1), độ tƣơng đồng 99 %.
Hình 3.18. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu BGS1 (H3) với trình tự mẫu F.
hepatica của Tây Ban Nha (AM709649.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (Mũi tên chỉ vào các vị trí nucleotide sai khác)
Trình tự ITS-2 của mẫu sán Bắc Giang (BGS1) sai khác 14 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709649.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình
3.18).
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 (H6) với trình tự mẫu F.
Trình tự ITS-2 của mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An (NA6) sai khác 14 nucleotide so với mẫu F. hepatica của Tây Ban Nha (AM709499.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình 3.19).
Hình 3.20. Kết quả so sánh trình tự ITS-2 của mẫu NA6 với trình tự mẫu F.
gigantica của Niger (AM850108.1) (độ tƣơng đồng 99%) trên GENBANK (Mũi tên chỉ vào các vị trí nucleotide sai khác)
Trình tự ITS-2 của mẫu trứng sán trên ngƣời tại Nghệ An (NA6) sai khác 5 nucleotide so với mẫu F. gigantica của Niger (AM850108.1), độ tƣơng đồng 99 % (Hình 3.20).
Nhƣ vậy, chúng tôi nhận thấy sau khi chạy Blast trên GENBANK, kết quả cho thấy mẫu trứng SLGL trên trâu bò tại Thanh Hóa (mẫu THT2) trong nghiên cứu này có mối quan hệ gần gũi với cả F. hepatica và F. gigantica của Niger (độ tƣơng đồng 99 %) (Hình 3.15 và hình 3.16); mẫu SLGL tại Bắc Giang (mẫu BGS1) trong nghiên cứu này có quan hệ gần gũi với SLGL F. gigantica của Niger và F. hepatica của Tây Ban Nha (độ tƣơng đồng 99 %) (Hình 3.17 và hình 3.18); mẫu trứng SLGL trên bệnh nhân tại Nghệ An (mẫu NA6) có quan hệ gần với SLGL F. gigantica của Niger và F. hepatica của Tây Ban Nha (độ tƣơng đồng 99%) (Hình 3.19 và hình 3.20).
Bảng 3.10. Vị trí biến đổi của nucleotide của vùng gen ITS-2 của mẫu sán [11]
Mẫu Vị trí nucleotide số 327 Tổng số cặp
nucleotide Định loại sán Australia (EU260058) T 362 F. hepatica
THT2 T 362 F. hepatica
BGS1 - 361 F. gigantica
NA6 - 361 F. gigantica
Indonesia (EU260080) - 361 F. gigantica
Sản phẩm PCR-RFLP sau khi giải trình tự đƣợc so sánh với ITS-2 của các mẫu ở Indonesia (đặc trƣng cho loài F. gigantica thuần) và mẫu ở Australia (đặc
trƣng cho loài F. hepatica thuần) [11, 44]. Kết quả cho thấy tại vị trí 327, mẫu
THT2 có chứa nucleotide T, mẫu BGS1 và mẫu NA6 khơng có nucleotide T (Bảng 3.10). Nhƣ vậy, mẫu trứng trên trâu bị tại Thanh Hóa giống với F. hepatica, mẫu sán trƣởng thành tại Bắc Giang và mẫu trứng trên ngƣời tại Nghệ An giống với F.
gigantica. Kết quả này trùng với kết quả của Nguyễn Thị Giang Thanh và CS (2010) [22], Nguyễn Văn Đề (2011) [11], Lê Thanh Hòa và CS (2008) [44].
Bảng 3.11. Sự sai khác và mức độ tƣơng đồng về nucleotide của các mẫu SLGL tại điểm nghiên cứu với F. gigantica của Niger
Ký hiệu Nơi phân lập Số nucleotide sai khác (nu) Tỷ lệ tƣơng đồng (%) F.g_NG Niger 0 100 Fas.BG Bắc Giang 13 98,59 Fas.NA Nghệ An 5 99,47
Fas.TH Thanh Hóa 13 98,59
Bảng 3.11 cho thấy trình tự chuỗi nucleotide gen ITS-2 của các mẫu SLGL trong nghiên cứu này có tỷ lệ tƣơng đồng cao so với F. gigantica của Niger. Mẫu
SLGL của Bắc Giang và mẫu trứng SLGL trên trâu bị tại Thanh Hóa có 13 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 98,59 %. Mẫu trứng SLGL trên ngƣời tại Nghệ An có 5 nucleotide sai khác và mức độ tƣơng đồng đạt 99,47 %.