Các loại nanosensor
Nanosnesor vật lý Nanosensor hóa học Nanosensor sinh học
Khối lượng Áp suất Lực Sự di chuyển Thành phần hóa học Nồng độ Tương tác kháng nguyên/ kháng thể Tương tác DNA Tương tác enzym
Với sự phát triển của khoa học công nghệ hiện nay, các loại cảm biến hiện đại đã tích hợp các loại cảm biến riêng để tạo thành cảm biến hỗn hợp, và rất khó để có thể phân loại được nữa. Rất nhiều dạng cảm biến mới được chế tạo như:
Chemical nanosensors: là thiết bị nano có thành phần cảm biến bằng vật
liệu sinh học, mặt khác lại nhạy cảm với các chất hóa học.
Biological nanobiosensors:làcác thiết bị nanocóphầncảm biếnlàm bằng
Physical nanobiosensors : là các thiết bị nanocóphầncảm biến bằng vật
liệusinh họcvànhạy cảm với cácđại lượng vật lý.
1.4.2 Một số loại cảm biến (nanosensor) sử dụng chấm lượng tử với hiệu ứng FRET FRET
Chấm lượng tử chất bán dẫn có cường độ phát quang rất mạnh so với các chất huỳnh quang hữu cơ. Qd có hiệu suất lượng tử cao, độ hấp thụ quang mạnh, tính ổn định quang lớn. Đồng thời ta có thể điều khiển bước sóng phát quang theo độ lớn kích thước của hạt Qds. Với nhiều lợi điểm như vậy, nên chấm lượng tử được sử dụng làm cảm biến sinh học để quan sát và chụp ảnh tế bào sinh học.
a. Nanosensor xác định hàm lượng Maltozơ
Mauro đã sử dụng Qd để chế tạo sensor theo hiệu ứng FRET bằng công nghệ tự lắp ghép phân tử. Sơ đồ cơ chế hoạt động của sensor này như hình dưới. [32]
Hình 1. 13: Mơ hình cơ chế hoạt động của Sensor hiệu ứng FRET dùng Qd của Mauro[32]
Như mơ hình trên, trên bề mặt của Qd phủ một lớp chất Protein: Maitose- Bindung Protein (MBP). Chất này có khả năng tạo chức năng hoạt hố bề mặt Qd trong dung dịch đường. Sau đó cho thêm chất B-Cyclo.dextrin-Qsy9 với vai trị là chất dập tắt tín hiệu huỳnh quang (Quencher). Sensor này khi sử dụng để xác định hàm lượng Maltose. Nếu trong mơi tường có chất Maltol, tương tác giữa Maltol với tác nhân Quencher, đẩy chất dập tắt quencher ra xa khỏi Qd. Kết quả theo hiệu ứng FRET, cường độ phát quang của chấm lượng tử gia tăng. Lợi dụng kỹ thuật này, bằng việc sử dụng chấm lượng tử, người ta có thể chế tạo sensor lai tạo (Hybrid sensor).
TRẦN THỊ THANH HỢP 29
b. Nanosensor xác định DNA
Cũng từ nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai đoạn tạo ra loại Sensor DNA nano bằng việc sử dụng Qd để xác định các DNA. Trong kỹ thuật này, các nhà phát minh đã sử dụng Qd là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ thuật Core-Shell làm chất cho (Donor). Trên bề mặt của chấm lượng tử được biến tính hoạt hố bằng chất Streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và Biotin tác dụng với chất Oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hố với vai trị khác nhau: tác nhân thơng tin (Reporter probe) và tác nhân liên kết (Capture probe). Hai nhóm phân tử chức năng này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích DNA). Cụm phân tử hai chức năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với Qd đã biến tính (Steptavidin Conjugated Qd), tạo thành biosensor DNA nano. Biosenssor DNA nano này có nhóm biotin kết hợp với chất Steptavidin trên bề mặt Qd. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính xác cao. Hình 1.14 là mơ hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano.[24]
Hình 1. 14: Mơ hình và cơ chế hoạt động của Biosensor DNA nano Qd (a,b) và thiết bị kiểm tra (c).[29]
Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang Qd có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy nhiều loại biosensor để xác định ảnh in vivo được nghiên cứu chế tạo.
c. Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim
Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự tại đại học Hanyang Hàn quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Protease bằng nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET.[10]
Nghiên cứu nàycho thấy việc phát hiện hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các chấm lượng tử (QDs). Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng QDs cho cấu trúc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh học (Bret), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi trong hiệu suất truyền năng lượng. Đặc biệt là do các đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể được xem như một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán rằng QD dựa trên Fret/Bret như một đầu dị sẽ có một tiềm năng lớn trong việc phân tích vai trị cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease như thuốc điều trị sinh học dạng nano medicine.
FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến sinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng hồi phục trạng thái tốt, và khả năng quan sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện hoạt động protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptit hữu cơ. Ví dụ cho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên các photon hiệu ứngFRET, như mô tả trong hình1.15A.
Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi mơi trường, khó khăn trong việc phân tích tổ hợp donor và acceptor. Như đã nói ở trên, những vấn đề này trong các
TRẦN THỊ THANH HỢP 31
nghiên cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt được sử dụng kết hợp với chấm lượng tử (QDs) (Hình 1.15B). Từ QDs có dải hấp thụ rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việc theo dõi lâu dài và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như các donor trong khi các chất nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptit được biến tính thích hợp.
Hình 1. 15: Sơ đồcảm biếnFRETcơ bảnđể phát hiện cácprotease hoạt động. (A) Q trình FRET thơng thường(B)FRET sử dụng QDs. D và A cho các nhà tài trợ
năng lượng và chấp nhận năng lượng, tương ứng.
d. Kiểm tra hoạt động của enzim
Nhóm nghiên cứu của Yizang tại đại học John Hopkins đã và đang nghiên cứu nhằm chế tạo nanosensor sử dụng QD-FRET để theo dõicác hoạt động của các enzime khác nhau phát triển từ các nghiên cứu trước đây của Medintz và cộng sự. QDs có thể phục vụ như giàn đỡ nano để cố định enzim hoặc các chất nền của enzim trên bề mặt QD. Trong khi đó, QD cũng được dùng với chức năng như bộ
chuyển đổi tín hiệu đem lại các thơng tin về cấu trúc phân tử, cấu tạo, và tương tác thơng qua cơ chế QD-FRET.[32]
Hình 1. 16: Minh họa sơ đồ của nanosensor QD-FRET để phân tích hoạt động của enzyme.
a)Nanosensor QD-FRETnhằm mục đích nghiên cứuprotezơ. b) Nanosensor QD-FRETcho việc nghiên cứuprotein kinase.
c) Nanosensor QD-FRETcho việc nghiên cứuDNA polymerase.[32]
Protezơ là một trong những enzim đầu tiên được nghiên cứu bằng cảm biến nano QD-FRET. Medintz và cộng sự đã dùng chất phát huỳnh quang hoặc chất khử
để đánh dấu peptit trên QDs thông qua polyhistidine để hình thành cảm biến nano
QD-peptit. Sự phát huỳnh quang của các nanosensor QD đã bị dập tắt bởi những chất nhận phù hợp thông qua mối liên kết peptit mà chuỗi này có thể được nhận biết
TRẦN THỊ THANH HỢP 33
bởi caspase-1, collagenase, hoặc chymotrypsin. Khi có phản ứng nhận biết bởi các enzim tương ứng, các peptit bề mặt sẽ tách ra để giải phóng huỳnh quang chất nhận từ liên kết tự động giữa QD-peptit, dẫn đến sự phục hồi phát huỳnh quang của QD như khi chưa có liên kết, được mơ tả như hình 1.16a.
Protein kinase là một nhóm các enzim quy định chức năng tế bào quan trọng thơng qua q trình phosphoryl hóa bằng cách kích hoạt hoặc khử hoạt một loạt các enzim. Sử dụng một hệ thống cảm biến QD-FRET, Ghadiali và cộng sự nghiên cứu hoạt động của các thụ thể tyrosine kinase Abl và Src. Peptit được cố định trên bề mặt QD. Sau khi phosphoryl hóa, một Alexa647 gắn vào kháng thể đơn phosphotyrosine cụ thể, đây là một nhóm phosphoryl với chất nhận FRET (hình 1.16b).
Mức độphosphoryl hóa được xác định bằng tỷ lệ của cường độ phát xạ acceptor/donor. Các hệ thống tương tự cũng được sử dụng để định lượng enzim bị ức chế thông qua chuẩn độ staurosporine để đánh giá độ nhạy của mộ thệ thống cảm biến QD-FRET kinase như một nền tảng để xây dựng một hệ kiểm tra chất gây nghiện.
Ngoài các enzim"tự lắp ghép", các loại khác của họ enzim liên quan đến phản ứng thêm các nhóm chức năng hoặc monome các mẫu axit nucleic. Chúng rất quan trọng đối với DNA trong việc nhân rộng, sửa chữa, sao chép hoặc truyền tín hiệu. Các"phản ứng cộng" tạo điều kiện cho sự kết hợp của chất phát huỳnh quangvới các phân tử mục tiêu, tạo điều kiện cho một loạt các chất phát huỳnh quang có thể được áp dụng.[32]
Chương 2 - THỰC NGHIỆM 2.1 Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm
- Clenbuterol (C12H18Cl2N2O) khối lượng mol phân tử là 277.19 g/mol
- N-1-Naphtylethylene diamine Dyhydrocloride (C12H14N2.2HCl)
- Natri nitrite (NaNO2), axit clohidric (HCl), natri hidroxit (NaOH)
- Rohdamine B (C28H31ClN2O3) khối lượng mol phân tử là 478.5 g/mol
Tất cả các hóa chất được cấp bởi Merck ở mức độ phân tích, khơng phải tinh chế trước khi sử dụng.
- Chấm lượng tử CdTe nồng độ 10-4M được bọc bởi axit 3-mercaptopropionic
(bước sóng 530 nm) do Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam cung cấp.
2.2 Sensor để xác định Rhodamine B
Trong khuôn khổ luận văn này mục đích của tôi là nghiên cứu chế tạo sensor dựa vào hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) để xác định Rhodamine B. Sensor để xác định Rhodamine B bao gồm có QDs CdTe đóng vai trị là chất cho huỳnh quang, còn Rhodamine B đóng vai trị là chất nhận huỳnh quang.
Chuẩn bị dung dịch chấm lượng tử CdTe: Pha dung dịch QDs CdTe 10-4M thành
100 ml dung dịch QDs CdTe 10-6M để dùng cho thí nghiệm. Mỗi mẫu sử dụng 1ml
CdTe này.
Chuẩn bị dung dịch chất màu:Lấy 0,01g Rhodamine B nguyên chất cho vào
bình định mức 100ml, thêm nước cất để tạo thành 100ml dung dịch Rhodamine B nồng độ 104g/ml.
Chuẩn bị dung dịch đo:Với mỗi lần thí nghiệm sử dụng cố định 1ml CdTe, thêm
lượng Rhodamine B 10-4 g/ml và nước cất thích hợp để được 4ml dung dịch và
TRẦN THỊ THANH HỢP 35