1.3.1 Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) là cơ chế mà trong đó một điện tử có thể truyền năng lượng kích thích khơng bức xạ của nó cho một điện tử độc lập khác ở một khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử).
Hình 1. 9: Mơ hình hiệu ứng FRET
Một cặp hai nguyên tử tạo ra một điện trường qua sự tương tác lưỡng cực. Đầu tiên sự hấp thụ ánh sáng xảy ra ở nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích thích. Trước khi donor có thể phát huỳnh quang và quay trở về trạng thái ban đầu, nó đang ở trạng thái kích thích nên truyền năng lượng cho nguyên tử nhận (aceptor molecule) gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon ảo. Nguyên tử cho (The donor) trở về trạng thái cơ bản còn nguyên tử nhận trở lên trạng thái kích thích (hình 1.9).
Kết quả cuối cùng là phần tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thích nhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất tự nhiên. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó khơng phụ thuộc vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.
TRẦN THỊ THANH HỢP 23
1.3.2 Cơ sở lý thuyết của hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng
Tư tưởng chính của lý thuyết về FRET có thể tóm lược trong một vài ý chính như sau:
Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác ở trạng thái cơ bản như là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khi chúng được định xứ gần nhau. Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của q trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom. Sơ đồ của q trình truyền năng lượng cộng hưởng mơ tả như hình dưới:
Hình 1. 10: Giản đồ Jablonski mơ tả hiệu ứng FRET.[22]
Trong quá trình phát huỳnh quang truyền năng lượng, một ion bị kích thích ban đầu (donor D) sẽ truyền năng lượng kích thích của nó cho một ion (aceptor) khác
gần nhất theo sơ đồ sau: D* + A D + A*. (dấu ‘ * ‘ ký hiệu trạng thái kích
thích.)
Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:
(i) Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử các chất cho phải chồng lên phổ
hấp thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chéo lên nhau được gọi là quang phổ chồng lên nhau tích hợp (J).
(ii) Chất cho (donor) phải có cường độ phát huỳnh quang mạnh
(iii) Hai chất này (các chất cho và chất nhận) phải ở khoảng cách gần nhau
(thường 1 đến 10 nanomet).
(iv) Các proentations chuyển tiếp lưỡng cực của các chất cho và chất nhận phải
gần như song song với nhau.
(v) Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử các chất cho phải có khoảng
thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra.
Hình 1. 11: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất cho và nhận. Khu vực màu đỏ nâu là sự chồng chéo quang phổ giữa quang phổ huỳnh quang của các
chất cho và phổ hấp thụ của chất nhận.[28]
Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chéo quang phổ giữa các cặp chất cho-chất nhận (hình 1.11), năng suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối của các chất cho-chất nhận những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ các chất cho tới chất nhận. Bất kỳ sự kiện hoặc q trình có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các cặp chất cho/chất nhận sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET.
Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET):
Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một
TRẦN THỊ THANH HỢP 25
mẫu vật có chứa cả các chất cho và các phân tử chất nhận với ánh sáng phát ra ở các bước sóng trung tâm gần với phát xạ. Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm phát huỳnh quang của các phân tử các chất cho cũng như tăng huỳnh quang của chất nhận, nên khi xác định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được.
Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì khơng phải tất cả các gốc chất nhận đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, những tương tác mà kết quả trong một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất mát tín hiệu.
Một phương pháp thay thế khác, ngày càng phổ biến nhanh chóng là để đo thời gian sống huỳnh quang của các chất cho trong sự hiện diện và vắng mặt của nhóm mang màu chất nhận. FRET sẽ gây ra sự giảm thời gian phát huỳnh quang của chất cho.
Hình 1. 12: Quang phổ huỳnh quang của chất cho và chất nhận và dung dịch hỗn hợp của chất cho và chất nhận
Trong hình trên, huỳnh quang của chất nhận tăng gần sáu lần trong sự hiện diện của chất cho. Trong trường hợp như huỳnh quang các chất cho trở thành 1/3 huỳnh
quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang của chất cho và nhận. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl- 2[3-octadecyl-2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất cho), Octadecyl rhodamine B (chất nhận).[28]