Thông thường, các ligand được cố định và liên kết với các giá thể là chất rắn, bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức (ví dụ như: cấu trúc bậc 1 của các nhóm amin, carboxylic axit, aldehyde…). Ví dụ như trường hợp protein dung hợp với đuôi glutathione S-transferase (GST) sẽ dựa vào ái lực giữa đuôi GST và chất khử glutathione. Hay là các protein dung hợp với như 6xHis, polyHis – là những đi có ái lực với kim loại hóa trị II như nickel hay cobalt. Một số đuôi dung hợp khác như HA, Myc, FLAG, SUMO hầu hết đều được gọi là đuôi epitope vì chúng địi hỏi phải có kháng thể đặc hiệu. Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng rộng rãi trong các phịng thí nghiệm vì hệ thống sử dụng khá là đơn giản, và hiệu suất cao.
1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel
Việc tinh sạch protein tái tổ hợp là điều kiện tiên quyết trong rất nhiều ứng dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Protein tái tổ hợp được biểu hiện với một loại protein dung hợp ở đầu N hoặc đầu C, giúp cho việc phát hiện và tinh sạch được diễn ra dễ dàng. Một trong những protein dung hợp được sử dụng đó là His-tag, nó gồm 6 – 9 histidine [35]. Vì kích thước rất nhỏ chỉ khoảng 0.84 kDa cho nên đuôi này khơng làm thay đổi nhiều độ tích điện hay thường không làm ảnh hưởng đến việc hình thành gấp xoắn, do đó khơng làm ảnh hưởng đến cấu trúc,
chức năng của protein [5]. Tuy nhiên đây cũng có thể là nhược điểm của phương pháp này, vì có thế có những tương tác khơng đặc hiệu với các protein tổng số có nhiều axit amin histidine.
Nguyên lý: Tinh sạch protein gắn đuôi His bằng phương pháp sắc ký ái lực kim loại cố định (Immobilized metal affinity chromatography gọi tắt là IMAC) dựa vào ái lực giữa nhóm axit amin Histidine và ion kim loại hóa trị II (Ni2+ hoặc Co2+) như Hình 10. Những ion kim loại này được cố định trên ma trận sắc ký bằng nitrilotriacetic acid (NTA) hoặc iminodiacetic acid (IDA) [4]. Điều kiện có thể thu protein gắn đuôi His từ phương pháp IMAC dựa vào tính cạnh tranh của imidazole với đi His.
Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [25] Phương pháp ái lực với đuôi His và Ni-NTA phụ thuộc vào cấu trúc bậc một của đi His, do đó protein gắn đi His có thể tinh sạch được ở điều kiện tự nhiên hoặc điều kiện biến tính. Điều này có thể giúp tinh sạch các protein ở dạng thể vùi khi biểu hiện ở mức độ cao ở E. coli. Protein gắn đi His có thể biểu hiện và tinh sạch từ nhiều hệ thống khác nhau, trong số đó, phương pháp tinh sạch bằng IMAC giúp thu được mức độ protein biểu hiện khá cao (từ 10-50 mg/l) và nhanh chóng [29].
1.5.2. Sắc ký ái lực Glutathione
Ái lực glutathione là phương pháp rất hiệu quả để tinh sạch protein có gắn đi dung hợp GST bằng một bước tinh sạch. Protein GST từ các nguồn khác nhau, tự nhiên, hay tái tổ hợp ở E. coli hay các vật chủ khác, đều có thể dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với glutathione, được thu hồi bằng cách rửa giải với lượng dư glutathione. GST có thể biểu hiện ở dạng tan trong tế bào E. coli với
lượng lớn và có hoạt tính. Hơn nữa, nhiều protein nhân thực khơng tan khi biểu hiện ở E. coli có thể tan một phần khi biểu hiện cùng protein dung hợp là GST [19]. Do đó, protein dung hợp GST được sử dụng phổ biến để làm tăng khả năng tan của một số protein khi biểu hiện ở E. coli [34].
Các bước tinh sạch và nguyên lý tinh sạch rất đơn giản gồm ba bước chính được mơ tả như Hình 11 [19]. Đầu tiên, dựa vào lực bám của tripeptide ligand glutathione với matrix được cố định (gel Sapharose) và lực tương tác của đuôi GST và glutathione giúp protein tái tổ hợp có thể gắn lên cột. Sau đó, các protein tạp được rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Cuối cùng, protein dung hợp GST hay GST đều dễ dàng thu được bởi dung dịch đệm có nồng độ glutathione từ 5-10 mM, dựa vào tương tác cạnh tranh của glutathione trong môi trường đệm và glutathione trên cột. Đối với các protein nghiên cứu cấu trúc, hay chức năng mà cần loại bỏ đi GST, thì có thể loại bỏ được bằng các protease như Thrombin, preScission hay factor Xa tùy thuộc vào vector lựa chọn. Phản ứng cắt này có thể phân cắt trực tiếp trên cột để thu được protein mong muốn loại bỏ đi GST hoặc có thể tiếp tục tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel…
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 DE3, vector biểu hiện pET-M (biến thể của vector pET 32a), vector biểu
hiện pGEX-4T-1 (Novagen). Các vật liệu này đều được nhận từ Phịng thí nghiệm sinh học phân tử tế bào thuộc Trung tâm khoa học sự sống, Khoa Sinh học, trường đại học Khoa học tự nhiên.
Trình tự gen mã hóa cho protein KOD DNA polymerase trên vector pUC19 và các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Kod-SalI R, Kod-BamHI F, Kod-EcoRI R, T7 promoter, T7 terminator, pGEX 3’, pGEX 5’, KOD F, KOD R được tổng hợp từ công ty TNHH MTV Phusa Biochem, Việt Nam. Các mồi có trình tự thể hiện trên Bảng 2.
Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng
Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)
T7 promoter TAATACGACTCACTATAGGG T7 terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG pGEX 3’ CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pGEX 5’ GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG KOD F GACCTATACCCTGGAAGCGG KOD R AATATATTYGCGGCCCCACG KOD-BamHI F GCggatccATTCTGGATACCGATTATATTACC KOD-EcoRI R CGgaattcTTAGGTGCCTTTCGGTTT KOD-SalI R CGgtcgacTTAGGTGCCTTTCGGTTT 2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các hãng uy tín như Bio-rad, Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Thermo scientific gồm có: Agarose, Amoni sulfat, axit acetic, Ampicilline, APS, acrylamide, Bis-Acrylamide, β- mercaptoethanol, BSA, Bromophenol blue, coomassie, DTT, EDTA, ethanol, SDS,
IPTG, Tris Base, Natri clorua, Kali clorua, glycerol, LB, LB agar, Methanol, Niken clorua, Urea, Glutathione, dNTPs (Thermo scientific), HisPurTM Ni-NTA Resin (Thermo scientific), Glutathione Sepharose 4B GST-tagged và một số hóa chất thông dụng khác trong sinh học phân tử.
Các loại enzyme và một số bộ kit như FastDigest BamHI, FastDigest
EcoRI, FastDigest SalI, T4 DNA ligase, PhusionTM Hot Start II High-Fidelity DNA
polymerase, bộ hóa chất tách chiết plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific), bộ hóa chất tinh sạch DNA MEGAquick-spinTM (iNtRON).
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu được đặt tại Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, Trung tâm khoa học sự sống và bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, được liệt kê ở Bảng 3.
Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ Hãng và nước sản xuất
Máy ly tâm lạnh 5430R Eppendorf (Đức)
Máy PCR Eppendorf (Đức)
Máy điện di Powerpac 300 Bio-Rad, America
Hệ thống soi gel Thermo Scientific, Mỹ
Máy điện di DNA Mupid-EXU Nhật Bản
Máy lắc ổn nhiệt Hàn Quốc
Máy quang phổ Thermo Scientific, Mỹ
Máy điện di protein LONZA LONZA, Thụy Sĩ
Bể ổn nhiệt Memmert, Đức
Máy quang phổ nanodrop
Máy siêu âm LABONIC® M LABONIC® M, Đức
Máy chuẩn độ pH cầm tay HANNA
Cột tinh sạch Econo-column Biorad
Pipet, đầu tip, ống Eppendorf, ống
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được sơ đồ hóa các bước như Hình 12.