Protein KOD-GST được biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 và được cảm ứng bởi IPTG
(đường chạy KOD-GST có IPTG), so sánh với tế bào khơng bổ sung IPTG (đường chạy K IPTG), KOD-GST được tinh sạch ở đường chạy KOD-GST elute.
3.4. Thẩm tách protein
Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được thẩm tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet P- 40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở - 20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.
3.5. Thử hoạt tính enzyme
Xác định hoạt độ enzyme
Để xác định hoạt độ enzyme KOD-His và KOD-GST, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để xác định lượng enzyme tối ưu cho một phản ứng PCR, so sánh với enzyme Phusion DNA polymerase của Thermo scientific 2U/µl. Thực hiện phản ứng PCR với lượng enzyme bổ sung cho mỗi phản ứng lần lượt là 0.3; 0.5; 1; 2 enzyme. Kết quả đối với enzyme KOD-His ở Hình 26 cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR có bổ sung 0.5 µl hoặc 1 µl KOD-His đóng vai trị xúc tác đều có băng sáng nhất trong các nồng độ. Bằng mắt thường, so sánh tương đối độ đậm và độ sáng nét của sản phẩm PCR dùng 0.5 µl enzyme KOD-His với băng tạo thành bởi 0.2 µl enzyme thương mại Phusion 2U/µl (Thermo scientific), chúng tơi ước lượng hoạt độ của KOD-His sau khi tinh sạch khoảng 0.8U /µl, tương đương với khoảng 800-1000 đơn vị trên mỗi ml enzyme tinh sạch được.