Phương pháp sắc ký ái lực là phương pháp phân tách và tinh sạch một phân tử đặc hiệu từ một nhóm các phân tử trong một hỗn hợp. Phương pháp này dựa trên mối tương tác sinh học đặc hiệu giữa hai phân tử ví dụ như giữa kháng nguyên và kháng thể, enzyme và cơ chất, hay chất cho và chất nhận. Những mối tương tác này được ứng dụng để tinh sạch một trong các phân tử tương tác, được gọi là phối tử ái lực (affinity ligand), trên một ma trận chất rắn ở pha tĩnh, còn các phân tử đích ở pha động.
Có rất nhiều biến thể trong quy trình tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực nhưng đều dựa trên ba bước cơ bản được mơ tả cụ thể ở Hình 9. Đầu tiên, ủ mẫu (tế bào đã được ly giải, serum) trong mơi trường đệm thích hợp để mẫu có thể bám vào phối tử ái lực trên cột (ligand). Sau đó, hỗn hợp được rửa bỏ các thành phần, các chất không đặc hiệu bằng dung dịch đệm mà vẫn duy trì được ái lực của phân tử đích và ligand. Cuối cùng, phân tử đích từ hỗn hợp với ligand được thu bằng dung dịch đệm làm thay đổi ái lực của phân tử đích và ligand.
Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực
Thông thường, các ligand được cố định và liên kết với các giá thể là chất rắn, bằng cách hình thành các liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm chức (ví dụ như: cấu trúc bậc 1 của các nhóm amin, carboxylic axit, aldehyde…). Ví dụ như trường hợp protein dung hợp với đuôi glutathione S-transferase (GST) sẽ dựa vào ái lực giữa đuôi GST và chất khử glutathione. Hay là các protein dung hợp với như 6xHis, polyHis – là những đi có ái lực với kim loại hóa trị II như nickel hay cobalt. Một số đuôi dung hợp khác như HA, Myc, FLAG, SUMO hầu hết đều được gọi là đi epitope vì chúng địi hỏi phải có kháng thể đặc hiệu. Phương pháp sắc ký ái lực được sử dụng rộng rãi trong các phịng thí nghiệm vì hệ thống sử dụng khá là đơn giản, và hiệu suất cao.
1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel
Việc tinh sạch protein tái tổ hợp là điều kiện tiên quyết trong rất nhiều ứng dụng để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Protein tái tổ hợp được biểu hiện với một loại protein dung hợp ở đầu N hoặc đầu C, giúp cho việc phát hiện và tinh sạch được diễn ra dễ dàng. Một trong những protein dung hợp được sử dụng đó là His-tag, nó gồm 6 – 9 histidine [35]. Vì kích thước rất nhỏ chỉ khoảng 0.84 kDa cho nên đuôi này khơng làm thay đổi nhiều độ tích điện hay thường khơng làm ảnh hưởng đến việc hình thành gấp xoắn, do đó khơng làm ảnh hưởng đến cấu trúc,
chức năng của protein [5]. Tuy nhiên đây cũng có thể là nhược điểm của phương pháp này, vì có thế có những tương tác khơng đặc hiệu với các protein tổng số có nhiều axit amin histidine.
Nguyên lý: Tinh sạch protein gắn đuôi His bằng phương pháp sắc ký ái lực kim loại cố định (Immobilized metal affinity chromatography gọi tắt là IMAC) dựa vào ái lực giữa nhóm axit amin Histidine và ion kim loại hóa trị II (Ni2+ hoặc Co2+) như Hình 10. Những ion kim loại này được cố định trên ma trận sắc ký bằng nitrilotriacetic acid (NTA) hoặc iminodiacetic acid (IDA) [4]. Điều kiện có thể thu protein gắn đi His từ phương pháp IMAC dựa vào tính cạnh tranh của imidazole với đi His.
Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [25] Phương pháp ái lực với đuôi His và Ni-NTA phụ thuộc vào cấu trúc bậc một của đi His, do đó protein gắn đi His có thể tinh sạch được ở điều kiện tự nhiên hoặc điều kiện biến tính. Điều này có thể giúp tinh sạch các protein ở dạng thể vùi khi biểu hiện ở mức độ cao ở E. coli. Protein gắn đi His có thể biểu hiện và tinh sạch từ nhiều hệ thống khác nhau, trong số đó, phương pháp tinh sạch bằng IMAC giúp thu được mức độ protein biểu hiện khá cao (từ 10-50 mg/l) và nhanh chóng [29].
1.5.2. Sắc ký ái lực Glutathione
Ái lực glutathione là phương pháp rất hiệu quả để tinh sạch protein có gắn đi dung hợp GST bằng một bước tinh sạch. Protein GST từ các nguồn khác nhau, tự nhiên, hay tái tổ hợp ở E. coli hay các vật chủ khác, đều có thể dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với glutathione, được thu hồi bằng cách rửa giải với lượng dư glutathione. GST có thể biểu hiện ở dạng tan trong tế bào E. coli với
lượng lớn và có hoạt tính. Hơn nữa, nhiều protein nhân thực khơng tan khi biểu hiện ở E. coli có thể tan một phần khi biểu hiện cùng protein dung hợp là GST [19]. Do đó, protein dung hợp GST được sử dụng phổ biến để làm tăng khả năng tan của một số protein khi biểu hiện ở E. coli [34].
Các bước tinh sạch và nguyên lý tinh sạch rất đơn giản gồm ba bước chính được mơ tả như Hình 11 [19]. Đầu tiên, dựa vào lực bám của tripeptide ligand glutathione với matrix được cố định (gel Sapharose) và lực tương tác của đuôi GST và glutathione giúp protein tái tổ hợp có thể gắn lên cột. Sau đó, các protein tạp được rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Cuối cùng, protein dung hợp GST hay GST đều dễ dàng thu được bởi dung dịch đệm có nồng độ glutathione từ 5-10 mM, dựa vào tương tác cạnh tranh của glutathione trong môi trường đệm và glutathione trên cột. Đối với các protein nghiên cứu cấu trúc, hay chức năng mà cần loại bỏ đi GST, thì có thể loại bỏ được bằng các protease như Thrombin, preScission hay factor Xa tùy thuộc vào vector lựa chọn. Phản ứng cắt này có thể phân cắt trực tiếp trên cột để thu được protein mong muốn loại bỏ đi GST hoặc có thể tiếp tục tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel…
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng chủng vi khuẩn biểu hiện E. coli BL21 DE3, vector biểu hiện pET-M (biến thể của vector pET 32a), vector biểu
hiện pGEX-4T-1 (Novagen). Các vật liệu này đều được nhận từ Phịng thí nghiệm sinh học phân tử tế bào thuộc Trung tâm khoa học sự sống, Khoa Sinh học, trường đại học Khoa học tự nhiên.
Trình tự gen mã hóa cho protein KOD DNA polymerase trên vector pUC19 và các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Kod-SalI R, Kod-BamHI F, Kod-EcoRI R, T7 promoter, T7 terminator, pGEX 3’, pGEX 5’, KOD F, KOD R được tổng hợp từ công ty TNHH MTV Phusa Biochem, Việt Nam. Các mồi có trình tự thể hiện trên Bảng 2.
Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng
Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’)
T7 promoter TAATACGACTCACTATAGGG T7 terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG pGEX 3’ CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG pGEX 5’ GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG KOD F GACCTATACCCTGGAAGCGG KOD R AATATATTYGCGGCCCCACG KOD-BamHI F GCggatccATTCTGGATACCGATTATATTACC KOD-EcoRI R CGgaattcTTAGGTGCCTTTCGGTTT KOD-SalI R CGgtcgacTTAGGTGCCTTTCGGTTT 2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này được mua từ các hãng uy tín như Bio-rad, Sigma (Mỹ), Merck (Đức), Thermo scientific gồm có: Agarose, Amoni sulfat, axit acetic, Ampicilline, APS, acrylamide, Bis-Acrylamide, β- mercaptoethanol, BSA, Bromophenol blue, coomassie, DTT, EDTA, ethanol, SDS,
IPTG, Tris Base, Natri clorua, Kali clorua, glycerol, LB, LB agar, Methanol, Niken clorua, Urea, Glutathione, dNTPs (Thermo scientific), HisPurTM Ni-NTA Resin (Thermo scientific), Glutathione Sepharose 4B GST-tagged và một số hóa chất thơng dụng khác trong sinh học phân tử.
Các loại enzyme và một số bộ kit như FastDigest BamHI, FastDigest
EcoRI, FastDigest SalI, T4 DNA ligase, PhusionTM Hot Start II High-Fidelity DNA
polymerase, bộ hóa chất tách chiết plasmid GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific), bộ hóa chất tinh sạch DNA MEGAquick-spinTM (iNtRON).
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu được đặt tại Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, Trung tâm khoa học sự sống và bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, được liệt kê ở Bảng 3.
Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ
Thiết bị và dụng cụ Hãng và nước sản xuất
Máy ly tâm lạnh 5430R Eppendorf (Đức)
Máy PCR Eppendorf (Đức)
Máy điện di Powerpac 300 Bio-Rad, America
Hệ thống soi gel Thermo Scientific, Mỹ
Máy điện di DNA Mupid-EXU Nhật Bản
Máy lắc ổn nhiệt Hàn Quốc
Máy quang phổ Thermo Scientific, Mỹ
Máy điện di protein LONZA LONZA, Thụy Sĩ
Bể ổn nhiệt Memmert, Đức
Máy quang phổ nanodrop
Máy siêu âm LABONIC® M LABONIC® M, Đức
Máy chuẩn độ pH cầm tay HANNA
Cột tinh sạch Econo-column Biorad
Pipet, đầu tip, ống Eppendorf, ống
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Quy trình nghiên cứu được sơ đồ hóa các bước như Hình 12.
Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD
− Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD
Trình tự axit amin của protein KOD từ vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 (gene bank: BAD84190.1) được lấy trên ngân hàng gen để tối
ưu mã bộ ba sử dụng phần mềm OptimumGene trên trang web GenScript. OptimumGene là phần mềm của công ty hàng đầu thế giới về dịch vụ tổng hợp gen. Các thuật toán mà OptimumGene đưa vào xem xét rất nhiều các yếu tố quan trọng liên quan đến giai đoạn khác nhau của biểu hiện protein, ví dụ như khả năng thích ứng codon, cấu trúc mRNA, yếu tố phiên mã và dịch mã. Các tham số được sử dụng trong phần mềm OptimumGene đó là chỉ số thích nghi codon (Codon Adaptation index – CAI), thành phần codon (codon context), Hàm lượng GC phân bố trong gen (GC content), cấu trúc bậc hai của mRNA và loại bỏ motif trong trình tự (Motif avoidance). Chỉ số CAI có giá trị dao động từ 0 đến 1. Giá trị CAI càng gần 1 thì
các gen có xu hướng sử dụng các codon phổ biến đối với hệ thống biểu hiện, giá trị CAI càng gần 0 thì các gen sử dụng các codon khơng hoặc ít được dùng trong hệ thống biểu hiện đó. Hàm lượng GC tốt nhất nên từ 30% - 70%, tỉ lệ GC càng cao thì lực liên kết giữa hai mạch sẽ lớn, gây khó khăn cho sự phá vỡ các liên kết trong việc tách mạch để PCR. Cấu trúc bậc hai của mRNA quyết định tính bền của phân tử, còn ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tham gia vào quá trình dịch mã tạo protein [1].
Trình tự gen nhận được từ phần mềm sẽ được kiểm tra lại vị trí cắt enzyme giới hạn, các chỉ số và được tổng hợp bằng phương pháp hóa học bởi cơng ty sinh hóa Phù Sa (PHUSA Biochem, Việt Nam).
− Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR
DNA đoạn chèn được khuếch đại bằng phản ứng PCR, sử dụng khuôn là vector pUC19-KOD. Mồi xuôi và ngược được sử dụng trong phản ứng PCR chứa vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn BamH I và EcoR I. 50µl hỗn hợp phản ứng gồm 1.5 µl plasmid pUC19-KOD (10 ng/µl), 1µl dNTPs 10 mM, 1.5 µl mồi xi và ngược, 5x Phusion HF buffer, 0.01 U Phusion DNA Polymerase (Thermo scientific). Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 98°C 30s, thời gian gắn mồi là 15 giây ở 62°C và thời gian kéo dài 60 giây ở 72°C. Sản phẩm PCR được phân tích trên gel agarose TAE 1% và tinh sạch sử dụng Gel Extraction Kit (Quiagen) dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD
− Cắt, nối gen vào vector biểu hiện
DNA mã hóa cho protein KOD sau đó được chèn vào vector biểu hiện pETM (vector pET-32a đã được loại bỏ S-tag và Thioredoxin tag). DNA đoạn chèn và plasmid pETM đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và EcoRI (Thermo
scientific). 10 µl sản phẩm PCR được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest buffer, 1 µl BamHI, 1.5 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl. Tương tự, 3
µl plasmid pETM cũng được cắt trong hỗn hợp gồm 4 µl 10x Fast Digest buffer, 1
µl BamHI, 1 µl EcoRI và thêm nước cho đủ thể tích 40 µl (Bảng 5). Hai hỗn hợp
theo tỉ lệ 1:1 và tinh sạch sử dụng bộ sử dụng Gel Extraction Kit (Quiagen) dựa trên hướng dẫn của nhà sản xuất.
Đối với gen được chèn vào vector pGEX-4T-1, DNA đoạn chèn và plasmid pGEX-4T-1 đều được cắt bởi enzyme cắt giới hạn BamHI và SalI (Thermo
scientific). Thể tích và thành phần của phản ứng cắt tương tự như đối với cắt gen vào vector pETM chỉ khác ở enzyme EcoRI được thay bằng SalI (Bảng 5).
Bảng 4: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn
Thành phần DNA Plasmid
H2O 23.5 µl 31 µl
10X Fast Digest buffer 4 µl 4 µl
BamHI 1 µl 1 µl
EcoRI/ SalI 1.5 µl 1 µl
Khn 10 µl 3 µl
Sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA sau đó được ủ với enzyme nối T4 DNA ligase với thành phần gồm 16 µl sản phẩm tinh sạch plasmid và DNA đoạn chèn, 2 µl 10X T4 DNA ligase, 2 µl T4 DNA ligase (Bảng 6). Quá trình nối được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong một tiếng. Sản phẩm nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3.
Bảng 5: Thành phần phản ứng nối
Thành phần DNA
10X T4 DNA ligase 2µl
T4 DNA ligase 2 µl
Khn (DNA+plasmid) 16 µl
− Biến nạp sản phẩm nối DNA vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3
Tế bào khả biến E. coli BL21 được lấy ra từ -80 °C và ủ trên đá. 20 µl hỗn hợp phản ứng nối được thêm vào 100 µl tế bào khả biến và ủ trên đá 20 phút. Tế bào sau đó được sốc nhiệt ở 42 °C, 1 phút trước khi ủ 5 phút trên đá. Bổ sung 500 µl LB lỏng vào tế bào, ủ ở 37 °C trong 15 phút, sau đó được ni lắc ở 37 °C, và trong một tiếng. Tế bào được ly tâm 6000 rpm trong 2 phút và loại bỏ 500 µl dịch
nổi. Lượng tế bào còn lại được hòa tan và cấy trải trên đĩa thạch LB chứa 100 µg/ml kháng sinh amp để chọn lọc. Tế bào được nuôi cấy ở đĩa thạch trong 37 °C qua đêm.
− PCR sàng lọc khuẩn lạc
Phương pháp PCR sàng lọc khuẩn lạc được sử dụng để xác nhận DNA đã được chèn vào vector. Chọn một vài khuẩn lạc mọc riêng rẽ có kích thước trung bình và đánh dấu số thứ tự trên đĩa thạch. Sử dụng đầu tip lấy một nửa khuẩn lạc được đánh dấu và hịa tan tế bào này trong 50 µl nước cất đã khử trùng trong ống microcentrifuge, hỗn hợp này được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được tiến hành trong 10µl hỗn hợp chứa 2µl 5X HF buffer, 0.2 µl dNTPs 10 mM, 0.3 µl mồi T7 promoter và T7 terminator (Bảng 3) đối với vector pET-M và cặp mồi pGEX 3’ và 5’ đối với vector pGEX-4T-1, 0.002U Phusion DNA polymerase, 0.5 µl khn và nước. Phản ứng PCR được thực hiện trong 35 chu kỳ với thời gian biến tính 15s ở 98 °C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C, mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.
− Phân lập plasmid DNA
Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong 10 ml LB lỏng chứa ampicillin 100 µg/ml, ở 37 °C, qua đêm. 5 ml dịch nuôi cấy qua đêm thu được ly tâm 13000 rpm, 2 phút để thu tế bào. Plasmid được tách chiết sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được trong 40 µl nước cất. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng A260 trên máy Nanodrop.
− Giải trình tự plasmid
Plasmid tách chiết được sử dụng làm khn cho phản ứng PCR để giải trình tự. Khoảng 10 ng plasmid được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự trong hỗn hợp chứa 0.6 µl mồi T7 promoter, 0.6 µl mồi T7 terminator, 2 µl 5X HF buffer, 0.4 µl dNTPs 10mM, 0.002U Phusion DNA polymerase và nước cho đủ thể tích 20 µl. Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ với thời gian biến tính 30s ở 98 °C, gắn mồi 10s ở 53 °C, kéo dài 1 phút ở 72 °C, mỗi chu kỳ. Sản phẩm PCR được