(A) Đường chạy KOD pETM: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và
EcoRI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn 1 kb của hãng intRon ở đường chạy M.
(B) Đường chạy KOD pGEX: sản phẩm PCR nhân gen KOD chứa trình tự cắt BamHI và
SalI ở hai đầu 5’ và 3’, so sánh với thang chuẩn DNA 1 kb ở đường chạy M..
3.1.3. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.
Sau khi có được sản phẩm PCR của gen mã hóa cho KOD DNA polymerase, chúng tôi tiến hành cắt, nối đoạn gen này vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1, sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli BL21 DE3. Tế bào nhận
plasmid và gen đã nối được cấy trải trên đĩa thạch LB và chọn lọc bởi kháng sinh ampicillin 100 mg/ml. Khuẩn lạc mọc được là khuẩn có thể chứa vector đã được chèn gen. Kết quả biến nạp ở Hình 14 cho thấy có khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa mơi trường có kháng sinh. Điều này chứng tỏ tế bào E. coli BL21 DE3 có khả năng đã mang vector tái tổ hợp mong muốn.
(A) KOD – pET-M (B) KOD – pGEX-4T-1
Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào
E. coli BL21 DE3.
(A) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen KOD và vector pET-M, (B) Đĩa thạch có amp được cấy tế bào E. coli BL21 được biến nạp sản phẩm nối của gen KOD và vector pGEX-4T-1.
Để xác định được chắc chắn vector pET-M đã mang gen KOD mong muốn, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator nhân từ 2 vùng biên của MCS trên vector để xác định đoạn gen đã được chèn vào vector. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ở Hình 14-A cho thấy khuẩn lạc số 3 trong số ba khuẩn lạc đã chọn ở sản phẩm nối với vector pET-M có xuất hiện băng có kích thước khoảng 2600 bp tương đương với kích thước tính tốn lý thuyết.
Tương tự với đĩa thạch của sản phẩm nối gen KOD với vector pGEX-4T-1 ở Hình 14-B, có khuẩn lạc số 5 trong số năm khuẩn lạc được lựa chọn có chứa băng DNA có kích thước khoảng 2400 bp tương đương với kích thước lý thuyết khi sử dụng cặp mồi pGEX 5’ và pGEX 3’ trên vector pGEX-4T-1.
A: BL21-pETM- KOD B: BL21-pGEX4T1- KOD Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc
A: Sản phẩm PCR các khuẩn lạc 1, 2, 3 chọn từ đĩa thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản
phẩm chèn gen KOD vào vector pETM được ký hiệu KL1, KL2, KL3, so sánh với thang chuẩn M1kb. B: sản phẩn PCR từ 5 khuẩn lạc từ đĩa từ thạch nuôi cấy tế bào E. coli chứa sản phẩm chèn gen KOD vào vector pGEX-4T-1 được ký hiệu KL1 đến KL5, so sánh với thang chuẩn 1 kb (M).
Hai khuẩn lạc từ hai đĩa thạch cho sản phẩm PCR có kích thước mong muốn được lựa chọn và nuôi cấy trong môi trường LB lỏng để tách plasmid và PCR để gửi đi giải trình tự.
3.1.4. Kết quả tách chiết plasmid DNA
Khuẩn lạc chứa DNA đoạn chèn đúng kích thước được chọn lọc từ phản ứng PCR khuẩn lạc được chuyển sang nuôi cấy qua đêm trong LB lỏng và dùng để tách chiết plasmid sử dụng GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA plasmid thu được được điện di trên gel agarose 1% và cho kết quả băng sáng rõ trên Hình 16. Nồng độ plasmid được đo ở bước sóng A260 là 150 ng/µl và 138 ng/µl lần lượt với plasmid pETM-KOD và pGEX- 4T-1-KOD.
Hình 16: Kết quả điện di plasmid
A – Sản phẩm điện di plasmid pETM-KOD, B – Sản phẩm điện di plasmid pGEX-4T-1 KOD
3.1.5. Giải trình tự plasmid
Plasmid tách chiết được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR để giải trình tự. Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5% cho kết quả có một băng sáng (Hình 17) và đủ tiêu chuẩn để gửi đi đọc trình tự ở cơng ty 1st BASE (Malaysia) theo phương pháp Sanger. Trình tự của KOD được giải bằng cặp mồi T7 promoter và T7 terminator; Kod-F và Kod-R để xác định đoạn gen đã được chèn đúng khung đọc và xác định chính xác trình tự của tồn bộ đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase.
A B Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid
A: Kết quả PCR kiểm tra plasmid pETM-KOD từ hai vùng biên để giải trình tự, B: Kết quả PCR có khn là plasmid pGEX4T1-KOD
Trình tự gen thu được tiếp tục được dịch mã thành trình tự axit amin sử dụng công cụ SnapGene và được so sánh với trình tự axit amin của KOD gốc. Kết quả so sánh trình tự bằng cơng cụ tin sinh CLUSTALW được trình bày ở Hình 18. Kết quả so sánh trình tự chỉ ra rằng, trình tự gen mà chúng tơi chèn vào vector biểu hiện pET-M hay pGEX-4T-1 giống với trình tự gốc, chỉ khác ở trình tự giải được trên vector pET-M có chứa trình tự cắt thrombin và đuôi 6xHis, cịn trên vector pGEX-4T-1 có chứa trình tự cắt thrombin. Như vậy kết quả chứng tỏ gen KOD đã được chèn vào vector biểu hiện khơng có đột biến và đã đúng khung đọc của vector.
Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc
Trình tự amino acid kí hiệu KOD (tương ứng cho KOD trên ngân hàng gen), pGEX4t1Kod: tương ứng với trình tự KOD trên vector pGEX-4T-1, pETMKod là trình tự axit amin trên vector pETM. Đi peptide chứa 6 histidine và trình tự cắt thrommbin (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (đỏ). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.
3.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp
Gen mã hóa cho KOD DNA polymerase trên vector pET-M và pGEX-4T-1 được biến nạp và biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 (DE3). Chủng E. coli BL21 là chủng được thiết kế mang gen khử tính độc của promoter T7 sử dụng trong hệ thống vector biểu hiện pET, ngồi ra nó cũng được dùng để biểu hiện được với hệ thống promoter tac trong vector biểu hiện pGEX-4T-1. Tế bào chứa vector tái tổ hợp được biểu hiện trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin với nồng độ chất cảm ứng IPTG 0.3 mM trong 16 tiếng. Kết quả biểu hiện KOD DNA polymerase được phân tích bằng phương pháp điện di SDS-PAGE thể hiện trên Hình 19 và 20.
Kết quả biểu hiện protein KOD gắn đuôi Histidine (KOD-His) được thể hiện trên Hình 19. Ở đường chạy thứ 3, mẫu tế bào có cảm ứng bằng IPTG 0.3 mM (mẫu BL21-KOD-His + IPTG) đã xuất hiện băng đậm có kích thước gần 92 kDa.
Kích thước này tương ứng với kích thước của KOD DNA polymerase có gắn đi His. Trong khi đó, ở mẫu đối chứng (mẫu BL21-KOD-His khơng IPTG), khơng có băng protein có kích thước tương ứng này. Kết quả này chứng tỏ rằng, protein KOD-His đã được biểu hiện trong tế bào BL21 (DE3).
Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-His +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-His không IPTG (mẫu không có chất cảm ứng IPTG.
Tương tự, Hình 20 thể hiện kết quả biểu hiện protein tái tổ hợp KOD gắn đi GST. Ở giếng BL21-KOD-GST +IPTG, có một băng đặc trưng kích thước của protein KOD có gắn đi GST (KOD-GST) khoảng 116 kDa, kích thước này bao gồm protein KOD (90 kDa) và đuôi GST (26 kDa). Trong khi, ở giếng đối chứng thì khơng có băng này. Như vậy, protein KOD gắn đi GST đều được biểu hiện thành công ở nồng độ IPTG 0.3 mM và ở 37°C.
Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21
Mẫu BL21-KOD-GST +IPTG là mẫu cảm ứng biểu hiện bằng IPTG 0.3 mM được so sánh với mẫu đối chứng là BL21-KOD-GST khơng IPTG (mẫu khơng có chất cảm ứng IPTG).
3.3. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực
3.3.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực nickel ở trạng thái tự nhiên
Sau khi biểu hiện thành cơng protein KOD có gắn đi Histidine, chúng tôi tiếp tục tiến hành tinh sạch protein này bằng phương pháp sắc ký ái lực, sử dụng cột có gắn ion nickel. Do được biểu hiện bằng hệ thống vector biểu hiện pET-M nên protein tạo ra có thêm 1 trình tự gồm 6 axit amin Histidin. Trình tự His-tag này giúp protein tái tổ hợp có thể bám với hạt nikel trên cột, còn các protein khác sẽ bị rửa trôi bởi dung dịch đệm rửa. Protein tinh sạch được phân tích trên gel SDS-PAGE 10% và được thể hiện trên Hình 21. Trên đường chạy cuối cùng, KOD-His là sản phẩm protein sau khi tinh sạch, có xuất hiện băng chính KOD, tuy nhiên vẫn còn rất nhiều băng protein tạp. Do đó, cần có các quy trình tối ưu quá trình tinh sạch protein KOD-His.
Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His
M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu khơng có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch.
Do kết quả tinh sạch ở điều kiện thường không cho kết quả tốt, do đó, chúng tơi đã tối ưu quy trình tinh sạch protein KOD-His với nhiều phương pháp khác như dùng nhiệt độ để loại bỏ các băng tạp, hay tinh sạch ở điều kiện biến tính protein sử dụng Urea ở các nồng độ khác nhau.
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel kết hợp biến tinh bằng nhiệt
Dựa vào tính bền nhiệt của DNA polymerase và một số nghiên cứu tinh sạch các loại DNA polymerase khác đã áp dụng phương pháp dùng nhiệt để biến tính các protein khác [12, 18, 32]. Chúng tôi đã tiến hành ủ dịch tế bào sau phá vỡ ở nhiệt độ 75°C trong 15 phút để loại bỏ các protein tổng số, tuy nhiên kết quả ở hình 22 cho thấy, lượng protein tái tổ hợp tồn tại hầu hết ở pha cặn (mẫu Tủa sau ủ 75) so sánh với pha dịch sau khi ủ ở 75°C (Dịch pv sau ủ 75) thì băng protein KOD-His đã giảm đi đáng kể. Mẫu tinh sạch protein ở giếng cuối (Dịch tinh sạch) cũng khơng có băng protein KOD-His. Như vậy nhiệt độ có thể làm ảnh hưởng đến tính tan của KOD DNA polymerase, khi những protein bám vào polymerase bị phân hủy thì kéo theo KOD DNA polymerase cũng tồn tại ở pha cặn.
Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt
M: thang chuẩn protein. Đường chạy KOD-His +IPTG là kết quả biểu hiện protein có chất cảm ứng IPTG được so sánh với mẫu khơng có IPTG ở đường chạy K IPTG. Đường chạy cuối cùng là protein KOD-His sau khi tinh sạch
− Kết quả tinh sạch protein KOD-His bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ở điều kiện biến tính bằng Urea
Khi tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính bằng Urea, chúng tơi đã lựa chọn các nồng độ Urea khác nhau 2M, 4M hay 6M. Hình 21-A là kết quả tinh sạch ở điều kiện biến tính với hệ đệm có bổ sung Urea 2M, protein KOD-His (KOD-His + IPTG) được biểu hiện so sánh với giếng K IPTG, không được thêm chất cảm ứng. Tế bào có biểu hiện sau đó được phá vỡ bằng sóng siêu âm, phần dịch phá vỡ (Dịch pv) vẫn xuất hiện băng protein tái tổ hợp được tinh sạch trên cột nickel. Kết quả tinh sạch proteins KOD-His ở đường chạy cuối cùng (Dịch tinh sạch) cho thấy vẫn cịn rất nhiều băng phụ. Do đó, chúng tôi đã tăng nồng độ Urea lên 4M, kết quả được thể hiện ở Hình 21- B cho thấy protein KOD tinh sạch (mẫu Dịch tinh sạch) đều vẫn còn protein tạp.
A B
Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính.
A – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính sử dụng Urea nồng độ 2M, protein KOD-His tinh sạch được thể hiện ở giếng cuối (Dịch tinh sạch). B – Kết quả tinh sạch KOD-His trong điều kiện biến tính với Urea nồng độ 4M, protein sau tinh sạch được điện di ở giếng cuối (Dịch tinh sạch).
Kết quả điện di SDS-PAGE ở Hình 24 so sánh protein tinh sạch ở điều kiện khơng biến tính và biến tính trên cột Nickel. Kết quả cho thấy protein KOD-His khi tinh sạch ở điều kiện biến tính (Elute 2M, 4M, 6M) băng protein phụ có mờ đi nhưng băng protein tái tổ hợp cũng giảm đi so với protein tinh sạch ở điều kiện thường (Elute).
Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và khơng biến tính. M: thang chuẩn protein, Elute: Dịch tinh sạch protein KOD-His so sánh với dịch tinh sạch M: thang chuẩn protein, Elute: Dịch tinh sạch protein KOD-His so sánh với dịch tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính với nồng độ Urea 2M, 4M và 6M.
3.3.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST
Sau khi biểu hiện thành công protein KOD gắn đuôi GST, chúng tôi tiến hành tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST. Được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện vector pGEX nên protein biểu hiện được gắn đi GST có kích thước khoảng 26 kDa, do đó protein được tinh sạch nhờ ái lực của đuôi GST với cột glutathione. Kết quả tinh sạch protein được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE. Kết quả điện di thể hiện trên Hình 20, ở làn chạy dịch tinh sạch KOD-GST elute có một băng đậm kích thước tương đương với protein KOD-GST. Tuy nhiên vẫn còn xuất hiện một số băng protein tạp. So sánh với phương pháp tinh sạch protein KOD có gắn đi Histidine thì KOD có gắn đi GST có độ tinh sạch cao hơn, có thể do độ đặc hiệu của đuôi GST tốt hơn với đuôi Histidine.
Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST.
Protein KOD-GST được biểu hiện trong tế bào E. coli BL21 và được cảm ứng bởi IPTG
(đường chạy KOD-GST có IPTG), so sánh với tế bào khơng bổ sung IPTG (đường chạy K IPTG), KOD-GST được tinh sạch ở đường chạy KOD-GST elute.
3.4. Thẩm tách protein
Protein sau khi được tinh sạch sẽ được thẩm tách trong 1 lít dung dịch đệm A (50mM Tris-HCl pH 8.0, 0.3M NaCl) trong 6 tiếng. Sau đó, protein được thẩm tách tiếp trong 1 lít dung dịch đệm B (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl) qua đêm. Cuối cùng protein được thẩm tách chuyển sang dung dịch đệm bảo quản (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Nonidet P- 40, 0.5% Tween 20, 50% glycerol). Enzyme trong dung dịch bảo quản được để ở - 20°C và sử dụng cho các phản ứng kiểm tra hoạt tính enzyme.
3.5. Thử hoạt tính enzyme
Xác định hoạt độ enzyme
Để xác định hoạt độ enzyme KOD-His và KOD-GST, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR để xác định lượng enzyme tối ưu cho một phản ứng PCR, so sánh với enzyme Phusion DNA polymerase của Thermo scientific 2U/µl. Thực hiện phản ứng PCR với lượng enzyme bổ sung cho mỗi phản ứng lần lượt là 0.3; 0.5; 1; 2 enzyme. Kết quả đối với enzyme KOD-His ở Hình 26 cho thấy sản phẩm của phản ứng PCR có bổ sung 0.5 µl hoặc 1 µl KOD-His đóng vai trị xúc tác đều có băng sáng nhất trong các nồng độ. Bằng mắt thường, so sánh tương đối độ đậm và độ sáng nét của sản phẩm PCR dùng 0.5 µl enzyme KOD-His với băng tạo thành bởi 0.2 µl enzyme thương mại Phusion 2U/µl (Thermo scientific), chúng tơi ước lượng hoạt độ của KOD-His sau khi tinh sạch khoảng 0.8U /µl, tương đương với khoảng 800-1000 đơn vị trên mỗi ml enzyme tinh sạch được.
Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His
Phản ứng PCR với khn có kích thước 400 bp sử dụng enzyme KOD-His với thể tích lần lượt 0.3; 0.5; 1; 2 µl, so sánh với 0.2 µl enzyme Phusion của hãng Thermo scientific
Tương tự với protein KOD-GST chúng tôi cũng tiến hành PCR xác định