Xác định hoạt độ alpha amylase theo phương pháp wohlgemuth
1.1Nguyên tắc
Phương pháp dựa vào tìm nồng độ enzyme thấp nhất có thể thủy phân tinh bột đến dextrin.Đơn vị Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn1 mg tinh bột đến dextrin sau 30 phút ở 37oC có Cl-
làm chất hoạt hóa.
59
Dụng cụ và hóa chất
11 ống nghiệm, pipet 1ml (4 cái), tủ ấm, NaCl 0,5%, tinh bột 0,5%, H2SO4 10%, Iodine 0,3% trong KI 3%.
1.2 Tiến hành
• Chuẩn bị dịch chiết amylase
Cân khoảng 10 g malt xay cả vỏ, chuyển vào bình định mức 100ml, định mức đến 100ml, lắc thật kỹ.Ngâm 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều bình định mức. Lọc qua 2 lần giấy lọc mịn, thuđược dịch trong suốt chứa enzyme amylase (có thể dùng dung dịch alpha amylase đã pha lỗng để thay thế).
• Tiến hành khảo sát hoạt độ enzyme amylase.
Lấy 10 ống nghiệm đánh số thứ tự.Hút vào mỗi ống nghiệm 1 ml dung dịch NaCl 0,5%.
Trong ống nghiệm 1 cho vào 1ml dung dịch amylase và lắc kỹ.Sau đó lấy 1 ml từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm 2, lắc kỹ và lặp lại cho tới ống nghiệm 10 thì hút 1ml và bỏ đi. Trong mỗi ống nghiệm cho vào 1 ml dung dịch hồ tinh bột 0,5% lắc đều, để vào tủ điều nhiệt ở 37oC.Sau 30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống 1 ml H2SO4 10% và 2 giọt Iodine trong KI lắc đều. Kết quả được thể hiện trong bảng, có đánh dấu xanh (x), đỏ (đ) , nâu (n), vàng (v).
Bảng 4: Chuẩn bị dãy ống nghiệm với các nồng độ và độ pha lỗng khác nhau
Lấy ống nghiệm cịn lại (ống thứ 11) cho vào 3 ml nước cất, 2 giọt thuốc thử Iodine trong KI, so sánh màu của 10 ống nghiệm trên để xác định ống có nồng độ enzym thấp nhất thủy phân hoàn toàn tinh bột thành dextrin.
1.2 Tính kết quả
60
Lượng enzyme được cho vào ống nghiệm (1): n = m. V 1
V 2
Trong đó:
V1- Thể tích dịch chiết enzyme cho vào ống nghiệm (1) (1ml) V2- Thể tích dịch chiết enzyme (100 ml )
m- Lượng mẫu cân vật phẩm chứa enzyme (mg) Một đơn vị Wohlgemuth (W):
W = Fn
.5
Trong đó :
F- Độ pha lỗng của ống nghiệm có nồng độ enzyme nhỏ nhất thủy phân hồn tồn tinh bột ( ống nghiệm có màu trùng với màu của ống nghiệm 11)
Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 ml dịch chiết enzym ( NW): Nw = V 1n
. W
2 Xác định hoạt độ lipase 2.1Nguyên tắc
Dưới tác dụng của lipase, lipid bị thủy phân và giải phóng acid béo.Hàm lượng acid được chuẩn độ bằng kiềm.Hoạt độ của enzyme là lượng kiềm cần để trung hịa acid mới được hình thành.Cơ chất tốt nhất đối với lipase chính là lipid của cùng một đối tượng enzyme.
Hóa chất
Đệm acetate pH=4,7 (trộn CH3COOH 1N và CH3COONa 1N theo tỉ lệ 1:1), cồn 960, toluen, ether ethylic, NaOH 0.1 N, Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml nước cất. Dầu đậu nành tinh khiết.
Tiến hành
61
Cân 5g hạt đậu nành, nghiền thành bột mịn bằng cối sứ. Chuyển vào erlen, thêm 10ml nước cất, lắc đều trong 15 phút ở 30oC.
Cho thêm vào 1ml dầu đậu nành làm cơ chất và 5 ml đệm acetate với vài giọt toluene, lắc đều hỗn hợp ở 30o
C trong 24 giờ. Khi hết thời gian phản ứng, cho vào mỗi bình 25ml cồn 96o và 15ml ether, lắc đều và để yên 2 phút.
Chuẩn độ dung dịch bằng NaOH 0,1N với chỉ thị phenolphthalein 1%.
Lặp lại thí nghiệm 3 lần.Làm bình kiểm chứng tương tự như trên nhưng dịch chiết enzyme phải được đun cách thủy 10 phút để làm mất hoạt tính trước khi cho cơ chất vào.
2.2 Tính kết quả
Hoạt độ của lipase được biểu thị bằng số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ lượng acid tự do sinh ra do lipase trích từ 10g hạt thủy phân trong 24 giờ :
X = (a−b) .10. k m Trong đó:
a : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình thí nghiệm b : số ml NaOH dùng để chuẩn độ trong bình kiểm chứng k : hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,1 N
m : khối lượng hạt sử dụng
3 Khảo sát hoạt độ invertase 3.1Nguyên tắc invertase 3.1Nguyên tắc
Invertase là một enzyme thủy phân saccharose thành glucose và fructose.Dựa vào tính chất Iodine trong dung dịch kiềm có khả năng oxi hóa glucose để xác dịnh lượng glucose sinh ra bằng cách định phân Iodine dư với dung dịch Na2S2O3.
Hóa chất
• Saccharose 10%
• NaOH 0,1N: hịa tan 4 g NaOH cho đủ 1000 ml bằng nước nước
cất.
• Iodine 0,1N: cân 40 g KI và hòa tan với 100 mL nước cất trong bình cầu 1000-ml. Cân 12.7 g I2 cho vào bình cầu trên và lắc cho đến khi tan hoàn toàn. Nhỏ 3 giọt 37% HCl. Định mức cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• H2SO4 1N: hịa tan 27.7 ml H2SO4 96% cho đủ 1000 ml bằng nước cất.
• Hồ tinh bột 1%: 1 g hồ tinh bột hòa tan trong 100 ml. Đun cách thủy trong 15 phút.
• Dung dịch Na2S2O3 0,05N: cân 12.5 g Na2S2O3.5H2O trong nước cất cho đủ 1000 ml.
3.2Cách tiến hành
Điều chế dung dịch invertase: cân 1g men bánh mì, hịa tan vào 50ml nước cất, cho vào bình định mức 100ml, định mức tới vạch, lắc đều trong 5 phút. Để lắng, lọc lấy dịch lọc. Thực hiện 3 ống nghiệm như sau:
Bảng 5: Chuẩn bị ống nghiệm
Số ống
Dung dịch saccharose 10% (ml) Nước cất (ml)
Dịch enzyme (ml)
Dịch enzyme đã đun cách thủy 10 phút
Để 3 ống nghiệm trên ở nhiệt độ phịng thí nghiệm trong chính xác 30 phút sau đó dem đun cách thủy trong 10 phút.Ở từng ống nghiệm, hút ra 5ml hỗn hợp dung dịch cho vào một bình tam giác 250ml để xác định hàm lượng glucose
Xác định glucose: thêm vào mỗi bình tam giác 10ml dung dịch iodine 0,1N và 15ml NaOH 0,1N.
63
Chú ý nhỏ chậm từng giọt NaOH vào sao cho thời gian nhỏ kéo dài khoảng 2 phút.Để yên trong bóng tối 20 phút.Lấy ra, thêm vào 2ml H2SO4 1N.Định phân lượng iodine thêm thừa bằng Na2S2O3 0,05N với hồ tinh bột 1% làm chất chỉ thị.Lặp lại thí nghiệm 2-3 lần
3.3Tính kết quả
Hoạt độ của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose bị thủy phân bởi lượng ezyme có trong 1g men bánh mì trong một phút ở nhiệt độ phịng thí nghiệm
( V 1−V 2).A.B
1000.20.2 . a . b .t . m
Trong đó:
V1: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 1 V2: số ml dùng để định phân dung dịch ở ống nghiệm 2
A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống nghiệm (ml)
B: tổng thể tích dịch trích enzyme có được từ m (g) men bánh mì (ml) a: thể tích dung dịch đem xác định đường glucose (ml)
b: thể tích dịch trích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm (ml) t: thời gian thủy phân (phút)
4 Khảo sát động học và xác định hoạt độ enyme urease 4.1 Nguyên tắc urease 4.1 Nguyên tắc
Urease là một enzyme thủy phân đặc hiệu urea theo phản ứng:
Khi thêm formaldehyde vào môi trường sẽ tạo thành hexamethylene tetramine và giải phóng acid carbonic.
64
2(NH4)2CO3 + 2H2CO3
Dùng dung dịch kiềm chuẩn định phân lượng acid tạo thành sẽ tính được lượng urea bị thủy phân.
Hóa chất
• Ure 2%, 1/3 M
• Formol trung tính: cho 10 ml dung dịch 10% formol và erlen, bổ sung 2 ml 0.5%phenolphtalein. Nhỏ từng giọt 0.2N NaOH vào erlen cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt của phenolphtalein. Ghi nhận lượng 0.2N NaOH đã sử dụng (V ml). Căn cứ tỉ lệ dung dịch 10% formol và 0.2N NaOH đã sử dụng, tiến hành điều chế 100 ml 10% formol trung hịa (khơng được sử dụng phenolphtalein).
• Phenolphthalein 1%: 1.0g phenolphtalein được pha với 50 ml ethanol và 50 ml nước cất.
4.2 Cách tiến hành
• Điều chế dung dịch urease
• Cân 10 g đậu nành đã được xay thành bột khuấy vào 150 ml, cho vào bình định mức 250ml, định mức tới vạch bằng nước cất. Lọc và thu dịch lọc.
• Khảo sát động học
Chuẩn bị 2 dãy ống nghiệm, mỗi dãy 6 ống. Ở từng dãy cho lần lượt các dung dịch vào theo bảng sau:
Bảng 6: Chuẩn bị dung dịch mẫu
Ống nghiệm Ure1/3 (ml) Nước (ml) Dd urease 65
(ml)
• Đặt dãy thứ nhất vào bể ổn nhiệt 40oC, dãy thứ 2 vào tủ ấm 30oC trong chính xác 20 phút.
• Sau khi kết thúc thời gian thủy phân thì thêm vào mỗi ống nghiệm 5ml formol trung tính, lắc đều trong 2phút.
• Chuyển từng ống nghiệm sang erlen 100ml, tráng ống nghiệm với một ít nước cất. Thêm vài giọtphenolphthalein 1%, định phân với NaOH 0,05N. Lặp lại thí nghiệm 3 lần.
4.3 Tính kết quả:
Ở mỗi dãy ống nghiệm, tính tốn kết quả và ghi vào bảng sau:
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm
Ống nghiệm
NaOH dùng chuẩn độ (ml) Y= số mol ure bị phân hủy (mol)
[S] =số mol ure ban đầu
• Trên cùng một hệ trục tọa độ vẽ 2 đường cong biểu diễn lượng cơ chất bị thủy phân theo nồng độ cơ chất ban đầu ở 2 nhiệt độ (Y1 và Y2 theo [S])
• Vẽ đường thẳng biểu diễn sự biến thiên của 1/v theo 1/[S] ở 2 nhiệt độ thủy phân.
Trong đó:
v= d(S)/dt = Y/20 (v là vận tốc phản ứng thủy phân)
1
V
Trong đó:
66
Vmax: vận tốc thủy phân cực đại [S]: nồng độ cơ chất
Km: hằng số Michaelis-Menten
Các đường thẳng này sẽ cắt trục hoành và trục tung tại các giá trị nghịch đảo của của Km và Vmax.Hãy tính các trị số này ở từng chế độ nhiệt.
Xác định hoạt đô:
Thực hiện các ống nghiệm sau:
Bảng 8: Chuẩn bị ống nghiệm
Ống nghiệm
Ure 2% (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml)
Dd urease đã đun cách thủy (ml)
Mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40oC.Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5 ml formol trung tính, lắc đều trong 2 phút. Đổ lần lượt mỗi ống ra một erlen 100ml. Định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm chỉ thị.Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Tính kết quả: hoạt đơ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme urease có trong
1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.
( V 2−V 1) . A . k
20.1000 .2 . t . a . m
Trong đó:
V1, V4: số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2 a: Thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm
A:Tổng thế tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu cân
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N
5. Xác định hoạt độ của enzyme peroxidase
67
Enzyme Peroxidaza rất phổ biến trong thực vật và đóng vai trị quan trọng trong các q trình oxy hóa. Peroxidaza làm hoạt hóa các peroxide đặc biệt là H2O2. Peroxidaza xúc tác các phản ứng oxy hóa nhiều polyphenol và amin thơm tạo thành các phẩm vật khác nhau.
5.1Nguyên tắc
Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme peroxidaza phổ biến là phương pháp dựa trên sự oxy hóa pirogalol thành purpurogalin khi có H2O2.Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau:
Purpurogalin tạo thành dưới dạng kết tủa màu nâu không tan trong nước, nhưng rất dễ tan trong eter và H2SO4 đậm đặc. Tùy thuộc vào cơ chất được chọn dùng pH tối thích mỗi enzyme peroxidaza có thay đổi chút ít.
Đa số trường hợp thí nghiệm được tiến hành trong mơi trường kiềm yếu hoặc trung tính ở nhiệt độ thường 200C.Độ nhạy với nhiệt của enzyme peroxidaza rất cao, nó có thể bị vô hoạt ngay sau khi sôi. Độ nhạy của nó đối với sự dư H2O2 cũng rất lớn, do đó tiến hành xác định hoạt độ của enzyme trong những thể tích lớn, pha thật lỗng.
Lượng purpurogalin tạo thành có thể xác định bằng hai cách:
- Kết tủa purpurogalin sau khi lọc và rửa sạch, hòa tan bằng H2SO4 80% đem chuẩn bằng KMnO4 0.1N.
- Kết tủa purpurogalin rửa sạch, hòa tan trực tiếp bằng eter và đem xác định bằng phương pháp so màu, đối chiếu với purpurogalin tinh khiết tan trong eter.
Chú ý: Khi xác định hoạt độ enzyme Peroxidaza bằng phương pháp dùng piroganol làm
cơ chất cần chú ý là piroganol và H2O2 dùng trong thí nghiệm có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của nó, do đó lượng dùng trong thí nghiệm khơng được q giới hạn xác định. Ngoài ra phải tuân theo một cách nghiêm ngặt các trật tự quy định khi trộn lẫn thuốc thử và dịch chiết enzyme vào dung dịch H2O2 khi chưa thêm pirogalol.
Hóa chất
Dung dịch H2O2 1%, dung dịch pirogalol 1% pha trước khi dùng H2SO4 đậm đặc (d = 1.84); H2SO4 80%, KMnO4 0.1 N, Eter etylic, Purpurogalin tinh khiết, dung dịch đệm phosphate pH = 8 ÷ 9.
5.2 Phương pháp thực hiện
• Chuẩn bị dịch chiết peroxidaza:
Cần lấy vào cối sứ 2 -3-gram nguyên liệu (lá, rễ, hạt,). Nghiền thật cấn thận với 20ml dung dịch đệm phosphate pH = 8 ÷ 9, có thêm 4 giọt toluene hoặc chloroform và bột thủy tinh hoặc cát sạch (khơng có Fe). Chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình định mức 100ml bằng dung dịch đệm và sau đó thêm dung dịch đệm cho đến vạch. Lọc nước thu được dùng để xác định hoạt động của enzyme peroxidaza.
Cho vào bình tam giác 250ml dung dịch pirogalol 1% mới pha và cho thêm 1ml H2O2
1% giữ ở nhiệt độ như vậy (20 -250C) hỗn hợp cho vào trong máy điều nhiệt hay trên nồi cách thủy ở 250C và để yên trong một khoảng thời gian nhất định (15 phút – 20 giờ) tùy thuộc vào hoạt lực của enzyme.
• Song song với thí nghiệm kiểm chứng:
Lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml dung dịch enzyme peroxidaza đun sôi 10 phút với ống sinh hàn thu hồi. Làm nguội và cho thêm 10ml pirogalol 1%, 1ml H2O2 1% như ở mẫu thí nghiệm.
Trong thời gian phản ứng purpurogalin được tạo thành ở dạng kết tủa màu nâu. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 1 – 2ml H2SO4 đậm đặc.Lọc kết tủa purpurogalin trong mẫu thí nghiệm cũng như kiểm chứng qua phễu thủy tinh xốp (G - 2 ).Rửa kết tủa bằng nước cất cho đến khi nước rửa khơng cịn khử KMnO4. Sau đó hịa tan kết tủa trực tiếp trên phễu lọc bằng H2SO4 80% (10 -20ml) rửa phễu lọc bằng nước cất ( lượng rửa gấp 7 – 20 lần lượng acid đem dùng). Nếu pha lỗng khơng đủ nước, định phân sẽ khó, trái lại pha lỗng q mức sẽ làm kết tủa purpurogalin trở lại.
Đun nóng dung dịch thu được tới 50 -600C và chuẩn bằng dung dịch KMnO4, màu của dung dịch chuyển từ màu nâu sang màu thẫm rồi xanh nhạt và cuối cùng sang màu hồng khi dư 1 giọt KMnO4.
5.3Tính kết quả
Hoạt độ của peroxidaza được biểu thị bằng số ml KMnO4 0.1N ứng với 1 gram vật phẩm ngiên cứu khô sau 15 phút tác dụng. Hoạt độ peroxidaza có thể tính theo cơng thức:
HdPer =(a−
mb)
Trong đó:
69
a,b – số ml KMnO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm và kiểm chứng. m – trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứng 40 ml dịch chiết
enzyme đem phân tích.
6. Phân tích enzyme trong nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala.
Để đánh giá chất lượng của men bánh mì ngồi xác định hoạt lực các enzyme chung nếu cần thiết, nếu không, thường trong sản xuất đánh giá một số chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng men bánh mì và định lượng nó cho sản xuất như: hoạt lực enzyme zimaza, maltaza, đo độ nở của bột theo thời gian, nhiệt dộ với lượng men như nhau, xác định độ tạo váng,..
6.1 . Xác định hoạt lực enzyme zimaza hay maltala a. Nguyên tắc
Hoạt lực enzyme zimaza hay maltala biểu thị bằng thời gian cần thiết để tách ea được 10 ml khí CO2 khi sử dụng 20 ml dung dịch đường saccarroza, glucoza hay maltoza cùng với một lượng men ép cố định. ở đây thể hiện tốc độ lên men đường glucoza, maltoza hay saccarroza.Thông thường hoạt lực nằm trong khoảng 30 – 40 phút là men tốt, và hoạt lực maltaza không quá 80 -90 phút là men tốt.
b. Cách xác định
Dùng hệ thống micromanometre của Elesco.Cân lượng men ép khoảng 0.5g hay men khơ đã hoạt hóa khoảng 0.2 – 0.3 cho vào cốc nhỏ của hệ thống. Đổ vào cốc 10 ml nước cất 350C và khuấy thật cẩn thận thật đều được dung dịch huyền phù nấm men, cho thêm vào cốc 10 ml. Dung dịch đường glucoza, saccarroza hay maltoza 10% và đậy nắp trên kín vào ngay và chuyển van ba ngã từ vị trí A sang vị trí để cân bằng áp suất bên trong với khí quyển, sau đó van này chuyển vào vị trí B và đặt cốc điều nhiệt ở 350C.
Đánh dấu thời gian từ lúc khuấy huyền phù nấm men với dung dịch đường cho vào