Ống nghiệm
Ure 2% (ml) Nước cất (ml) Dd urease (ml)
Dd urease đã đun cách thủy (ml)
Mang tất cả các ống nghiệm đặt ở 40oC.Sau 20 phút cho vào mỗi ống 5 ml formol trung tính, lắc đều trong 2 phút. Đổ lần lượt mỗi ống ra một erlen 100ml. Định phân bằng NaOH 0,05N với phenolphtalein 1% làm chỉ thị.Lặp lại thí nghiệm 3 lần. Tính kết quả: hoạt đơ urease được biểu diễn bằng số mol ure bị thủy phân bởi lượng enzyme urease có trong
1g bột đậu nành trong thời gian 1 phút ở 40oC.
( V 2−V 1) . A . k
20.1000 .2 . t . a . m
Trong đó:
V1, V4: số ml NaOH 0,05N dùng định phân dung dịch trong ống nghiệm 1 và 2 a: Thể tích enzyme cho vào mỗi ống nghiệm
A:Tổng thế tích enzyme có được từ m(g) bột đậu nành t: thời gian thủy phân (phút)
m: khối lượng mẫu cân
k: hệ số hiệu chỉnh nồng độ NaOH 0,05 N
5. Xác định hoạt độ của enzyme peroxidase
67
Enzyme Peroxidaza rất phổ biến trong thực vật và đóng vai trị quan trọng trong các q trình oxy hóa. Peroxidaza làm hoạt hóa các peroxide đặc biệt là H2O2. Peroxidaza xúc tác các phản ứng oxy hóa nhiều polyphenol và amin thơm tạo thành các phẩm vật khác nhau.
5.1Nguyên tắc
Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme peroxidaza phổ biến là phương pháp dựa trên sự oxy hóa pirogalol thành purpurogalin khi có H2O2.Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau:
Purpurogalin tạo thành dưới dạng kết tủa màu nâu không tan trong nước, nhưng rất dễ tan trong eter và H2SO4 đậm đặc. Tùy thuộc vào cơ chất được chọn dùng pH tối thích mỗi enzyme peroxidaza có thay đổi chút ít.
Đa số trường hợp thí nghiệm được tiến hành trong mơi trường kiềm yếu hoặc trung tính ở nhiệt độ thường 200C.Độ nhạy với nhiệt của enzyme peroxidaza rất cao, nó có thể bị vơ hoạt ngay sau khi sơi. Độ nhạy của nó đối với sự dư H2O2 cũng rất lớn, do đó tiến hành xác định hoạt độ của enzyme trong những thể tích lớn, pha thật lỗng.
Lượng purpurogalin tạo thành có thể xác định bằng hai cách:
- Kết tủa purpurogalin sau khi lọc và rửa sạch, hòa tan bằng H2SO4 80% đem chuẩn bằng KMnO4 0.1N.
- Kết tủa purpurogalin rửa sạch, hòa tan trực tiếp bằng eter và đem xác định bằng phương pháp so màu, đối chiếu với purpurogalin tinh khiết tan trong eter.
Chú ý: Khi xác định hoạt độ enzyme Peroxidaza bằng phương pháp dùng piroganol làm
cơ chất cần chú ý là piroganol và H2O2 dùng trong thí nghiệm có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt độ của nó, do đó lượng dùng trong thí nghiệm khơng được q giới hạn xác định. Ngoài ra phải tuân theo một cách nghiêm ngặt các trật tự quy định khi trộn lẫn thuốc thử và dịch chiết enzyme vào dung dịch H2O2 khi chưa thêm pirogalol.
Hóa chất
Dung dịch H2O2 1%, dung dịch pirogalol 1% pha trước khi dùng H2SO4 đậm đặc (d = 1.84); H2SO4 80%, KMnO4 0.1 N, Eter etylic, Purpurogalin tinh khiết, dung dịch đệm phosphate pH = 8 ữ 9.
5.2 Phng phỏp thc hin
ã Chun b dch chiết peroxidaza:
Cần lấy vào cối sứ 2 -3-gram nguyên liệu (lá, rễ, hạt,). Nghiền thật cấn thận với 20ml dung dịch đệm phosphate pH = 8 ÷ 9, có thêm 4 giọt toluene hoặc chloroform và bột thủy tinh hoặc cát sạch (khơng có Fe). Chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình định mức 100ml bằng dung dịch đệm và sau đó thêm dung dịch đệm cho đến vạch. Lọc nước thu được dùng để xác định hoạt động của enzyme peroxidaza.
Cho vào bình tam giác 250ml dung dịch pirogalol 1% mới pha và cho thêm 1ml H2O2
1% giữ ở nhiệt độ như vậy (20 -250C) hỗn hợp cho vào trong máy điều nhiệt hay trên nồi cách thủy ở 250C và để yên trong một khoảng thời gian nhất định (15 phút – 20 giờ) tùy thuộc vào hoạt lực của enzyme.
• Song song với thí nghiệm kiểm chứng:
Lấy vào bình tam giác 250ml, 40ml dung dịch enzyme peroxidaza đun sôi 10 phút với ống sinh hàn thu hồi. Làm nguội và cho thêm 10ml pirogalol 1%, 1ml H2O2 1% như ở mẫu thí nghiệm.
Trong thời gian phản ứng purpurogalin được tạo thành ở dạng kết tủa màu nâu. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 1 – 2ml H2SO4 đậm đặc.Lọc kết tủa purpurogalin trong mẫu thí nghiệm cũng như kiểm chứng qua phễu thủy tinh xốp (G - 2 ).Rửa kết tủa bằng nước cất cho đến khi nước rửa khơng cịn khử KMnO4. Sau đó hịa tan kết tủa trực tiếp trên phễu lọc bằng H2SO4 80% (10 -20ml) rửa phễu lọc bằng nước cất ( lượng rửa gấp 7 – 20 lần lượng acid đem dùng). Nếu pha lỗng khơng đủ nước, định phân sẽ khó, trái lại pha lỗng q mức sẽ làm kết tủa purpurogalin trở lại.
Đun nóng dung dịch thu được tới 50 -600C và chuẩn bằng dung dịch KMnO4, màu của dung dịch chuyển từ màu nâu sang màu thẫm rồi xanh nhạt và cuối cùng sang màu hồng khi dư 1 giọt KMnO4.
5.3Tính kết quả
Hoạt độ của peroxidaza được biểu thị bằng số ml KMnO4 0.1N ứng với 1 gram vật phẩm ngiên cứu khô sau 15 phút tác dụng. Hoạt độ peroxidaza có thể tính theo cơng thức:
HdPer =(a−
mb)
Trong đó:
69
a,b – số ml KMnO4 0,1N dùng định phân mẫu thí nghiệm và kiểm chứng. m – trọng lượng mẫu thí nghiệm tương ứng 40 ml dịch chiết
enzyme đem phân tích.
6. Phân tích enzyme trong nấm men bánh mì: enzyme zimaza hay maltala.
Để đánh giá chất lượng của men bánh mì ngồi xác định hoạt lực các enzyme chung nếu cần thiết, nếu không, thường trong sản xuất đánh giá một số chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng men bánh mì và định lượng nó cho sản xuất như: hoạt lực enzyme zimaza, maltaza, đo độ nở của bột theo thời gian, nhiệt dộ với lượng men như nhau, xác định độ tạo váng,..
6.1 . Xác định hoạt lực enzyme zimaza hay maltala a. Nguyên tắc
Hoạt lực enzyme zimaza hay maltala biểu thị bằng thời gian cần thiết để tách ea được 10 ml khí CO2 khi sử dụng 20 ml dung dịch đường saccarroza, glucoza hay maltoza cùng với một lượng men ép cố định. ở đây thể hiện tốc độ lên men đường glucoza, maltoza hay saccarroza.Thông thường hoạt lực nằm trong khoảng 30 – 40 phút là men tốt, và hoạt lực maltaza không quá 80 -90 phút là men tốt.
b. Cách xác định
Dùng hệ thống micromanometre của Elesco.Cân lượng men ép khoảng 0.5g hay men khơ đã hoạt hóa khoảng 0.2 – 0.3 cho vào cốc nhỏ của hệ thống. Đổ vào cốc 10 ml nước cất 350C và khuấy thật cẩn thận thật đều được dung dịch huyền phù nấm men, cho thêm vào cốc 10 ml. Dung dịch đường glucoza, saccarroza hay maltoza 10% và đậy nắp trên kín vào ngay và chuyển van ba ngã từ vị trí A sang vị trí để cân bằng áp suất bên trong với khí quyển, sau đó van này chuyển vào vị trí B và đặt cốc điều nhiệt ở 350C.
Đánh dấu thời gian từ lúc khuấy huyền phù nấm men với dung dịch đường cho vào và quan sát sự tăng dần của dung dịch NaCl trong ống đo áp kế và xác định thời gian khi chất lỏng đó đã nâng lên được 10 ml. Thời gian này chính là đơn vị đo tốc độ lên men của đường này hoặc hoạt lực enzyme của nấm men.Các chủng nấm men khác nhau sử dụng trong sản xuất thường hoạt lực zimaza thay đổi trong khoảng 40 – 60 phút, còn hoạt lực maltaza sẽ từ 70 – 80 đến 160 phút.
70
Hình 7: Hệ thống micromanometre: 1. Cốc nhỏ 2. Nút kín. 3. Ống đo áp suất 4. Ống dẫn 5. Van ba ngã. 71
Chú ý: Sau khi phân tích xong sẽ đổ dung dịch ra bằng cách vặn van về vị trí mở lắp ra
và đổ dung dịch từ cốc ra, rửa cốc sạch, lau khô. Trước khi tiến hành xác định cần chuẩn bị:
- Rót dung dịch NaCl bão hịa với dung dịch methylen xanh vào lắp của ống đo áp kế. dung dịch rót từ đáy của ống đo và đánh dấu mức đó là mức 0.
- Vị trí xoay van phải đánh dấu bằng vaselin ống đo được khác độ với độ chính xác 1 ml = 20 mm.
Ghi chú: Có thể xác định nhanh bằng phương pháp tạo váng. Đây là phương pháp hay
dùng để đánh giá nhanh sơ bộ chất lượng của men ép hay men khơ của men bánh mì. Thường lấy 5g men ép hay 1 – 2g men khô, cho vào cốc nhỏ thêm 50 ml nước thường (hoặc cho thêm 2.5 – 5g đường).Hòa men vào cốc và quan sát bề mặt khi men nổi lên sau một phút.Nếu để lâu hơn 5 phút mà men chưa tạo váng là men chưa được tốt.Từ đó đánh giá các phương pháp lực nở để xác định lượng men cho vào bột thích hợp.
6.2Xác định lực nở nấm men bánh mì. a. Ngun tắc
• Dùng hộp nhơm hay tơn có kích thước xác định thơng thường có cấu tạo:
• Mặt trên của khuôn: 14.3 và 9.2 cm hay 150 x 100 mm
• Mặt dưới : 12.6 và 8.5 cm hay 140 x 90 mm
• Chiều cao: 8.5 cm hay 84 mm
• Dùng thanh gỗ đặt ngang qua bột và đặt lên thành hộp, đặt cao 1.5 cm. Để tính thời gian bột nở đến thanh gỗ đặt ngang trên bề mặt bột.
b. Cách xác định
Lấy 280g bột mì chất lượng tốt cho vào tủ ổn nhiệt trong 2 giờ ở nhiệt độ 300C.Cùng thời gian đó cân 5 gram men ép (cân chính xác đến 0.01g) và cho vào tủ ăn ở nhiệt độ 350C cùng với 160 ml nước muối 2.5%. Lấy 10 – 20 ml dung dịch nước muối cho vào chén có men.Lắc đều cho tới khi khơng vón cục, rồi đem đổ vào bình nhào bột của phịng hóa nghiệm, nhào với tốc độ 135 vịng/phút. Dung dịch muối cịn lại đổ vào thùng, rắc ít bột khơ lên rồi nhào lại trong vịng 5 phút. Nếu trong phịng hóa nghiệm khơng có máy nhào có thể nhào bằng tay, nhưng phải nhào kỹ đúng theo chế độ quy định.
Bột nhào xong nặn thành hình bành mì dài va để vào khn sắt ở trên. Dùng thanh gỗ để ngang qua bột, đặt cao 1.5 cm và cho vào tủ ấm 350C.Tính thời gian cho bột vào
72
khuôn đến khi thấy bột nở đến ngang thanh gỗ trong khn. Đó là thời gian nở của bột, hay qua đó đánh giá chất lượng men tốt hay men xấu.
Đối với men khơ: lấy 2.5 gram men hịa với 30 ml nước thường và đưa vào tủ ổn nhiệt để 300C trong 30 phút. Sau đó trộn với 15 gram bột và lại cho vào tủ ổn nhiệt để trong 2 giờ ở nhiệt độ trên.Đồng thời cho vào tủ ấm 350C, 265 gram bột (đã lấy 15 gram
ởtrên). Sau đó cho men vào với 130 ml dung dịch muối 2.5% và cho vào tủ ấm 30 – 350C.Nhào bột 5 phút và để xác định thời gian nở giống như men ép ở trên.
Quan sát khi bột nở đến bề mặt thanh gỗ, đánh giá thời gian đó là thời gian hay lực nở của men.