CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định danh vi tảo T weissflogii
3.1.1. Kết quả điện di
DNA tổng số của chủng tảo Thalassiosira sp. sau khi tách thành công được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR điện di trên gel cho kết quả như sau:
Giếng 1 (Mẫu Thalassiosira sp.) xuất hiện 1 băng duy nhất kích thước 800bp.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của chủng vi tảo Thalassiosira sp. là DNA
3.1.2. Kết quả giải trình tự DNA và định danh lồi TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTATCACACCGTTCCAAACC TTACATCCCCGTGAACTGGTGGCCGGCATTCCGTGCTGAACCGCCAAATATA ACATAAACAAAACCTATGTGTTGGGCCCGTAAAGAGCCGTGCAAAAGTACGG CTGACTGCGGGTTTCTCTGCCGCCCCAATACCAAATGAAAACTGAACCTGAA ACCAAGCCGTCTTTGGGGTTGTTCCCGCCCTTGGGTGGGAACGGCCGCTCTGA CTGTATAATCCATTACAACTTTCGCCAATGGATGTCTTGGATCCCACAACGAT GAAGAACGCAGCAAAATGTGATACGTATTGGAAATTGCAGGACCTCGTGAAT CATCAAAATTTTGAACGCGCATTGCGCTTTTGGGTAATGCCCAAGAGCATGCT CATCTGAGTGTTCCCAAACCCCACTCATCCTCTGCTGTGACTCACGTTGCGGT GGTGTGGTGGACTCTGACAGAGCCGGTCTTCCGGCTCTGTTGAAATTCAACA GATCAAAGTTGCGCCTGCATCCTGGAGGATTACGGACTGAAACAAATGCCAC CCTTGGATTTGGTAGATGCCCTTCGGTGTGTTTTCATGTCTGAGATGTGTTCGT GGAATCCGCCTGAGACCCGGTTGGGAGATTTCTTTGAAATGGAGCTGTTGTG GCATTGATTGTCTCTAGCTTCTCCGGCATACTCTTTTGTATGAATCTCACATTG AGTACCACTACACGCCGAGTTTAAGCATATCTTACGCCTGCAGAACTCCAAT CAGACAAGAATACCCGCTGAATTTAA
Hình 3.2. Tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi tảo Thalassiosira sp.
Chủng vi tảo Thalassiosira sp. có trình tự vùng gen ITS tương đồng 95.94% với lồi Thalassiosira weissflogii (Hình 3.2). Cho phép kết luận chủng vi tảo Thalassiosira sp. là loài Thalassiosira weissflogii.
Như vậy, qua bước định danh ở cấp độ loài, xác định được chủng vi tảo Thalassiosira
sp. là loài vi tảo Thalassiosira weissflogii. Do đó, trong những bước tiếp theo, tiến hành
nghiên cứu trên đối tượng này.
3.2. Ảnh hưởng của các loại mơi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ cấp
3.2.1. Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng đến sinh trưởng của vi tảo
Kết quả nghiên cứu cho thấy, các loại môi trường nuôi khác nhau có ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của lồi vi tảo T. weissflogii (Hình 3.3).
Hình 3.3. Đường cong sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các loại môi trường khác
nhau (Artificial seawater ASP-2 (AS - A); Artificial seawater ESAW (AS - E); Enriched seawater F/2 (ES - F); Enriched seawater Walne (ES - W)).
Nhìn chung, ở hai loại môi trường ASP-2 và F/2 mật độ tế bào có xu hướng tăng từ ngày ni cấy thứ 2 đến ngày thứ 10. Mặc dù ở 2 ngày nuôi cấy đầu tiên, mật độ tế bào trong môi trường ASP-2 thấp hơn 3 mơi trường cịn lại nhưng kể từ ngày thứ 4 trở đi, mật độ tế bào trong môi trường này lại cao nhất (0,2 ± 0,03 x 106 tế bào/mL). Trong khi đó, ở hai loại môi trường ESAW và Walne mật độ tế bào chỉ tăng mạnh trong 2 ngày đầu nuôi cấy nhưng sau đó chững lại và giảm dần ở những ngày tiếp theo. Mật độ cao nhất đạt được ở môi trường ESAW là 0,7 ± 0,05 x 105 tế bào/mL vào ngày thứ 6. Ở môi trường Walne mật độ tế bào đạt cao nhất vào ngày thứ 2 (0,49 ± 0,08 x 105 tế bào/mL) nhưng sau đó lại bắt đầu giảm dần cho đến ngày thứ 10.
Bên cạnh đó, khi so sánh về tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các loại môi trường khác nhau cũng cho thấy sự khác biệt khá rõ rệt (Hình 3.4, Bảng 3.1) (p- values<0,05).
Hình 3.4. Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các loại môi trường khác nhau
(Artificial seawater ASP-2 (AS - A); Artificial seawater ESAW (AS - E); Enriched seawater F/2 (ES - F); Enriched seawater Walne (ES - W)).
Bảng 3.1. Tốc độ sinh trưởng của T. weissflogii ở các môi trường khác nhau.
ASP-2 ESAW F/2 Walne
Tốc độ sinh trưởng /ngày
0,317 ± 0,022 0,203 ± 0,042 0,288 ± 0,048 0,078 ± 0,040
Tốc độ sinh trưởng ở 2 môi trường ASP-2 và F/2 khá tương đồng (p=0,35) với tốc độ sinh trưởng đạt được lần lượt là 0,317 ± 0,022 /ngày và 0,288 ± 0,048 /ngày. Trong môi trường ESAW, tốc độ sinh trưởng đạt 0,203 ± 0,042 /ngày, thấp hơn so với 2 loại môi trường kể trên. Môi trường Walne dường như không phải là môi trường thuận lợi cho sự phát triển của quần thể tảo T. weissflogii khi giá trị tốc độ sinh trưởng trung bình chỉ đạt
0,078 ± 0,039 /ngày, thấp hơn rất nhiều so với các mơi trường cịn lại (p-values<0,05).
3.2.2. Ảnh hưởng của các loại môi trường dinh dưỡng đến hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin của vi tảo T. weissflogii fucoxanthin của vi tảo T. weissflogii
Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin trong mỗi tế bào được đánh giá vào ngày ni cấy thứ 10 cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa các loại môi trường ni (p-values < 0,05) (Hình 3.5, Bảng 3.2).
Hình 3.5. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin trong tế bào ở các môi trường nuôi
khác nhau (Artificial seawater ASP-2 (AS - A); Artificial seawater ESAW (AS - E); Enriched seawater F/2 (ES - F); Enriched seawater Walne (ES - W)).
Bảng 3.2. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin của T. weissflogii ở các môi trường
khác nhau.
ASP-2 ESAW F/2 Walne
Chlorophyll a 16,81 ± 2,77 pg/tế 64,93 ± 13,44 pg/tế 6,350 ± 0,54pg/tế 139,41 ± 21,35 pg/tế Fucoxanthin 7,26 ± 0,98 pg/tế 27,49 ± 11,65 pg/tế 3,38 ± 0,43 pg/tế 57,57 ± 7,91 pg/tế
Cụ thể, hàm lượng chlorophyll a trong tế bào thu được cao nhất là ở môi trường Walne đạt 139,411 ± 21,352 pg/tế bào tiếp đến là môi trường ESAW với 64,935 ± 13,443 pg/tế bào. Ở môi trường ASP-2 và F/2 hàm lượng chlorophyll a trong tế bào thu được là thấp nhất và tương đương nhau (p = 0,74) lần lượt là 16,814 ± 2,772 pg/tế bào và 6,350 ± 0,543 pg/tế bào. Kết quả về hàm lượng chlorophyll a trong tế bào thu được ở các loại môi trường nuôi cấy khác nhau tỷ lệ nghịch với tốc độ tăng trưởng của vi tảo. Trong khi tốc độ tăng trưởng của môi trường ASP-2 và F/2 là lớn nhất nhưng hàm lượng chlorophyll a lại thấp hơn 12 lần so với mơi trường Walne - mơi trường có tốc độ sinh trưởng thấp nhất trong 4 loại.
Ngoài ra, khi đánh giá hàm lượng fucoxanthin nội bào ở các môi trường nuôi cho thấy rằng, giá trị hàm lượng fucoxanthin tích lũy cao nhất được ghi nhận ở mơi trường Walne (57,574 ± 7,910 pg/tế bào), thấp nhất ở 2 môi trường ASP-2 và F/2, hàm lượng fucoxanthin trong mỗi tế bào là tương đương nhau (p-values>0,05) với giá trị trung bình thu được là 5,32 ± 0,70 pg/tế bào.
3.3. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ và photpho đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ cấp của vi tảo T. weissflogii thứ cấp của vi tảo T. weissflogii
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ cấp của vi tảo T. weissflogii của vi tảo T. weissflogii
a. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii
Sau q trình ni cấy T. weissflogii dưới các nồng độ N khác nhau, nhìn chung khi nồng độ N thay đổi sẽ ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh trưởng của vi tảo (Hình 3.6).
Hình 3.6. Đường cong sinh trưởng vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ nitơ khác nhau.
Ở những ngày đầu nuôi cấy, đường cong sinh trưởng của T. weissflogii ở cả 3 nghiệm thức N1, N2 và N4 với nồng độ N lần lượt là 8,23 mgN/L, 16,46 mgN/L và 32,92mgN/L có xu hướng tăng dần và khá tương đồng với nhau. Tuy nhiên, ở nghiêm thức N4, quần thể vi tảo bước vào pha cân bằng khá sớm ( ngày nuôi cấy thứ 3) trong khi ở các nghiệm thức còn lại quần thể tảo vẫn tiếp tục phát triển và bắt đầu suy tàn ở ngày thứ 5. Ở nghiệm thức N0,5 với nồng độ N là 4,11 mgN/L, mật độ vi tảo tăng trưởng khơng ổn định trong q trình ni cấy, nhưng chiều hướng sinh trưởng của quần thể vẫn tiếp tục tăng cho đến ngày kết thúc thí nghiệm và đạt mật độ là 0,11 ± 0,04 x 106 tế bào/mL, cao hơn so với các nghiệm thức khác.
Đánh giá về tốc độ sinh trưởng ở các nghiệm thức nồng độ N khác nhau cho thấy, khi tăng hoặc giảm nồng độ N trong môi trường nuôi cũng sẽ ảnh hưởng nhiều đến tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii (Hình 3.7, Bảng 3.3). Tốc độ sinh trưởng của quần thể vi tảo tỉ lệ nghịch với nồng độ N được bổ sung trong môi trường. Càng tăng nồng độ N, tốc độ sinh trưởng của vi tảo càng giảm.
Hình 3.7. Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các nghiệm thức nitơ khác nhau. Bảng 3.3. Tốc độ sinh trưởng của T. weissflogii ở các nồng độ N khác nhau.
N0,5 N1 N2 N4
Tốc độ sinh trưởng /ngày
0,146 ± 0,073 0,082 ± 0,031 0,023 ± 0,087 -0,038 ± 0,029
Tốc độ sinh trưởng cao nhất ghi nhận được là 0,146 ± 0,07 /ngày ở nồng độ N0,5, mặc dù nồng độ N giảm đi một nửa (4,11 mgN/L) nhưng tốc độ sinh trưởng lại tương đồng so với các nghiệm thức N1 và N2 (8,23 mgN/L và 16,46 mgN/L). Ngược lại, bổ sung quá cao N (32,92 mgN/L) dường như gây ức chế cho quá trình sinh trưởng của vi tảo khi tốc độ sinh trưởng nhỏ hơn 0, thấp hơn nhiều so với các nghiệm thức còn lại (p-values<0,5).
b. Ảnh hưởng của nồng độ nitơ đến hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin của vi tảo T. weissflogii
Sự tích lũy chlorophyll a và fucoxanthin trong tế bào ở các nghiệm thức N khác nhau cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p-values<0,05) (Hình 3.8, Bảng 3.4).
Hình 3.8. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin trong tế bào ở các nồng độ nitơ khác nhau. Bảng 3.4. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin của T. weissflogii ở các nồng độ N
khác nhau. N0,5 N1 N2 N4 Chlorophyll a 4,79 ± 2,08 pg/tế bào 37,36 ± 1,69 pg/tế bào 75,11 ± 16,44 pg/tế bào 89,78 ± 7,79 pg/tế bào Fucoxanthin 0 pg/tế 8,26 ± 5,90 pg/tế bào 24,42 ± 1,54 pg/tế bào 27,97 ± 1,98 pg/tế bào
Tại nghiệm thức N0,5 có tốc độ tăng trưởng cao nhất nhưng khả năng tích lũy chlorophyll trong tế bào là thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại và chỉ đạt 4,791 ± 2,081 pg/tế bào thấp hơn 17,5 lần so với 2 nghiệm thức N2 và N4.
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc tăng giảm N trong môi trường nuôi sẽ tác động đến sự tích lũy fucoxanthin và chlorophyll a trong tế bào T. weissflogii (p-values<0,05) với xu hướng càng tăng dần nồng độ N sẽ đồng thời làm tăng hàm lượng cả hai hợp chất trong tế bào (Hình 3.8). Cuối quá trình khảo sát, hàm lượng fucoxanthin và chlorophyll trung bình cao nhất ghi nhận được tại nghiệm thức N2 và N4 lần lượt là 26,203 ± 1,76 pg/tế bào và 82,446 ± 1,122 pg/tế bào. Tại nghiệm thức N0,5 có tốc độ tăng trưởng cao nhất nhưng khả năng tích lũy chlorophyll trong tế bào là thấp nhất so với các nghiệm thức còn lại và chỉ đạt 4,791 ± 2,081 pg/tế bào thấp hơn 17,5 lần so với 2 nghiệm thức N2 và N4. Không ghi nhận được sự tích lũy fucoxanthin ở nghiệm thức N0,5.
3.3.2. Ảnh hưởng của photpho đến sinh trưởng và tích lũy các hợp chất thứ cấp của vi tảo T. weissflogii tảo T. weissflogii
Khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ P khác nhau đến sinh trưởng của T. weissflogii được thể hiện ở hình 3.9 cho thấy việc tăng giảm photpho trong môi trường nuôi cũng tác động đến sự sinh trưởng của vi tảo (Hình 3.9).
Hình 3.9. Đường cong sinh trưởng vi tảo T. weissflogii ở các nồng độ photpho khác
nhau.
Đối với hai nghiệm thức P2 và P4 có nồng độ P lần lượt là 1,76 mgP/L và 3,52 mP/L, có đường cong sinh trưởng tương tự nhau, mật độ tế bào tăng trưởng khơng ổn định trong q trình thử nghiệm. Ở nghiệm thức P1, mật độ tế bào tăng trưởng ổn định và đạt mật độ cực đại vào ngày thứ 5 (0,7 ± 0,09 x 105 tế bào/mL) sau đó giảm dần. Tương tự như ở nghiệm thức N, khi giảm nồng độ P xuống 0,5 lần thì mật độ tế bào lại cao hơn so với các nghiệm thức còn lại, giá trị cao nhất ghi nhận được tại ngày thứ 7 với 0,141 ± 0,03 x 106 tế bào/mL.
Hình 3.10. Tốc độ sinh trưởng của vi tảo T. weissflogii ở các nghiệm thức photpho khác
nhau.
Bảng 3.5. Tốc độ sinh trưởng của T. weissflogii ở các nồng độ P khác nhau.
P0,5 P1 P2 P4
Tốc độ sinh trưởng /ngày
0,186 ± 0,062 0,082 ± 0,031 0,108 ± 0,074 0,076 ± 0,065
Kết quả ảnh hưởng của P lên tốc độ sinh trưởng của vi tảo từ hình 3.10 và bảng 3.5 cho thấy, ở nghiệm thức giới hạn P (0,44 mgP/L) tốc độ sinh trưởng của T. weissflogii là
cao hơn (0,186 ± 0,062 /ngày) so với các nghiệm thức còn lại. Tại nghiệm thức với 3,52 mgP/L trong môi trường nuôi, tốc độ sinh trưởng của vi tảo chỉ đạt 0,076 ± 0,065 /ngày, thấp hơn so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, những sự khác biệt về tốc độ sinh trưởng giữa các nồng độ P là không đáng kể (p-values>0,05).
b. Ảnh hưởng của photpho đến hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin trong vi tảo T. weissflogii
Từ hình 3.11. cho thấy, nồng độ P có tác động đến sự tích lũy chlorophyll a và fucoxanthin trong tế bào vi tảo T. weissflogii (p-values < 0.05) (Hình 3.11, Bảng 3.6).
Hình 3.11. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin trong tế bào ở các nồng độ photpho.
Bảng 3.6. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin của T. weissflogii ở các nồng độ P
khác nhau. P0,5 P1 P2 P4 Chlorophyll a 14,79 ± 2,89 pg/tế bào 37,36 ± 1,69 pg/tế bào 30,63 ± 8,54 pg/tế bào 24,39 ± 2,24 pg/tế bào Fucoxanthin 0,38 ± 0,34 pg/tế bào 8,26 ± 5,90 pg/tế bào 6,92 ± 4,48 pg/tế bào 14,20 ± 4,02 pg/tế bào
Nhìn chung, việc tăng hay giảm nồng độ P cũng sẽ ảnh hưởng tiêu cực đến sự tích luỹ chlorophyll a. Hàm lượng chlorophyll a và fucoxanthin tích lũy trong tế bào có xu hướng càng tăng khi tăng nồng độ photpho trong môi trường và sẽ giảm khi giảm nồng độ photpho so với nghiệm thức đối chứng P1. Cụ thể, ở nghiệm thức P0,5 (0,44 mgP/L) chỉ thu được hàm lượng chlorophyll là 14,799 ± 2,89 pg/tế bào, trong khi đó ở nghiệm thức P1 và P2 trung bình thu được 34,001 ± 5,121 pg/tế bào cao gấp 2,29 lần so với P0,5. Tương tự, khi tăng nồng độ P lên 4 lần thì hàm lượng chlorophyll a thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng (P1) (p = 0,03) chỉ thu được 24,394 ± 2,44 pg/tế bào. Kết quả thống kê cho thấy,
việc thay đổi nồng độ P cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tích lũy fucoxanthin nội bào của vi tảo T. weissflogii (p-values < 0,05). Việc bổ sung nồng độ P ở mức 3,52 mgP/L sẽ kích thích vi tảo tích lũy fucoxanthin cao nhất với 14,206 ± 4,023 pg/tế bào kết quả này khá tương đương với nghiệm thức P1 và P2 và cao hơn 37,09 lần so với nghiệm thức P0,5 (0,383 ± 0,347 pg/tế bào).
3.4. Thảo luận
Kết quả đánh giá về các đặc điểm sinh học của vi tảo T. weissflogii ở 2 loại môi trường nuôi gồm nước biển nhân tạo (ASP-2, ESAW) và nước biển bán nhân tạo (F/2, Walne) cho thấy đối với nước biển nhân tạo, tốc độ sinh trưởng ở môi trường ASP-2 cao hơn 1,5 lần so với mơi trường ESAW. Kết quả này có thể là do sự có mặt của vitamin B8 (Inositol) trong mơi trường ASP-2. Inositol có vai trị quan trọng trong q trình phân chia tế bào vì nó phân hủy thành acid ascorbic, pectin sau đó kết hợp thành phosphoinositides và phosphatidylinositol (Saad and Elshahed, 2012; Wang and Ruan, 2013). Hợp chất này đã được sử dụng nhiều trong các môi trường nuôi cấy callus - hình thành từ sự phân chia nhiều lần của tế bào. Tuy nhiên, hàm lượng các hợp chất sinh học trong tế bào vi tảo ở môi trường ASP-2 lại thấp hơn 3,8 lần so với mơi ESAW. Bên cạnh đó, kết quả trực quan từ hình 3.12 cũng cho thấy rằng, thành tế bào vi tảo ở môi trường ESAW có cấu trúc thành tế bào dày hơn và nội chất tế bào cũng cao hơn so với tế bào ở môi trường ASP-2. Mặc dù ESAW là phiên bản môi trường nước biển nhân tạo cải tiến hơn so với ASP-2 nhờ sự cân bằng các ion trong thành phần dinh dưỡng gần giống với môi trường nước biển tự nhiên (Berges và cs, 2001), nhưng khi so sánh về tốc độ sinh trưởng thì chưa vượt trội bằng mơi trường ASP-2.
Hình 3.12. Tế bào T. weissflogii dưới vật kính 100X (Hình (a): Tế bào được ni trong
Đối với môi trường nước biển bán nhân tạo, tốc độ sinh trưởng ở môi trường F/2 cao hơn so với môi trường Walne. Sự khác biệt này có thể do thành phần biotin có trong mơi trường F/2. Biotin có chức năng như một chất mang carboxyl trong phản ứng acetyl-CoA Carboxylase. Trong khi đó, hàm lượng các hợp chất sinh học như chlorophyll a và fucoxanthin ở môi trường F/2 lại thấp hơn 22 và 39,5 lần so với môi trường Walne. So sánh hình thái giữa 2 tế bào ni trong 2 mơi trường cho thấy, ở hình 3.13, tế bào ni trong mơi trường F/2 có thành tế bào mỏng dễ gây ra hiện tượng vỡ tế bào và nội chất tế