3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian 3.1.1. Thời gian
Tiểu luận được thực hiện từ 1/5/2007 đến 30/7/2007 3.1.2. Địa điểm
Lấy mẫu tại một số trại heo (3 trại) tại Thành Phố Hồ Chí Minh và Đồng Nai. Xét nghiệm tại phịng thí nghiệm vi sinh khoa Chăn ni - Thú y trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. VẬT LIỆU, DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất 3.2.1. Thiết bị, dụng cụ, hoá chất
Lọ đựng mẫu, dung dịch glyxerin 60%.
Ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, cân điện tử và các dụng cụ cần thiết. Tủ ấm, tủ lạnh, lò viba, nồi hấp autoclave, micro-pipet.
3.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường TSC (Tryptose Sulfate Cycloserine Agar) hoặc môi trường Wilson -Blair. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Mẫu
3.3.1.1. Đối tượng lấy mẫu
Phân heo con theo mẹ sau khi sinh từ 1 - 28 ngày tuổi đang bị tiêu chảy chưa điều trị bằng kháng sinh hoặc bắt đầu điều trị.
Phân heo bình thường. 3.3.1.2. Khu vực lấy mẫu Thủ Đức và Đồng Nai.
21
3.3.1.3. Số lượng mẫu
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở 3 trại, mỗi trại lấy 20 mẫu theo nguyên tắc: 10 mẫu phân tiêu chảy và 10 mẫu phân bình thường. Trong trường hợp khơng đủ số lượng heo tiêu chảy thì vẫn lấy đủ số mẫu trên những con heo bình thường. Các mẫu được lấy phải được phân bố ngẫu nhiên trên những lứa tuổi khác nhau từ 1 đến 28 ngày tuổi.
3.3.2. Cách lấy mẫu
Cách lấy: Dùng dung dịch chống táo bón cho trẻ em (dung dịch glyxerin 60%), bơm vào hậu môn heo từ 2 - 4 ml để kích thích đi phân. Lấy mẫu trực tiếp ở thời điểm heo đi phân, cho vào một lọ sạch có nắp đậy. Sau khi lấy mẫu xong, đựng trong bình có chứa đá và vận chuyển về phịng thí nghiệm để phân tích ngay. Tại phịng thí nghiệm, mẫu được bảo quản ở 4 -10oC.
Thời gian vận chuyển và bảo quản không quá 12 giờ kể từ khi lấy mẫu. 3.4. NỘI DUNG THỰC HIỆN
Định lượng vi khuẩn Clostridium bằng phương pháp ni cấy kỵ khí trong ống nghiệm với môi trường TSC.
3.4.1. Đếm số lượng vi khuẩn Clostridium
Nguyên tắc: Clostridium là những trực khuẩn kỵ khí, Gram dương, di động, có khả năng phân giải protein tạo ra một số acid amin tự do chứa lưu huỳnh, các vi sinh vật dị dưỡng dùng men giải phóng lưu huỳnh và tạo ra khí H2S. H2S sinh ra sẽ phản ứng với sắt trong ferrous sulfate của môi trường và tạo ra một kết tủa màu đen không tan là FeS.
- Bước 1: Pha loãng mẫu
Cân 1 gram phân trong lọ sạch, thêm vào 9ml nước muối sinh lý 9 o/00 vô trùng. Nghiền và dàn đều trong nước muối sinh lý, ta có mẫu pha lỗng 1/10 (10-1). Sau đó cho 1 ml mẫu được pha loãng 1/10 vào ống chứa 9 ml nước muối sinh lý khác để
có mẫu pha lỗng 1/100 (10-2). Tiếp tục như thế để có các ống mẫu được pha lỗng 10 lần giảm dần đến 1/103 (10-3).
- Bước 2: Thực hiện cấy mẫu
Môi trường TSC (Tryptose Sulfate Cycloserine Agar) :
Dùng 60 ống nghiệm có nút vặn đã tiệt trùng, cho vào mỗi ống 20 ml TSC đã tan chảy sau đó cho vào nồi hấp hơi (autoclave) hấp tiệt trùng ở 121oC, 1atm/ 15 – 20 phút giờ và để môi trường trong tủ lạnh hoặc ở nhiệt độ phòng cho đến khi dùng để nuôi cấy.
Môi trường trước khi nuôi cấy phải được đun tan chảy và làm nguội cho đến 45 - 500C.
Mẫu được pha loãng ở các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3. Hút 1 ml mẫu đã được pha lỗng tới những nồng độ thích hợp trên cho vào tận đáy mơi trường và rút lên từ từ, đem đun cách thủy 80oC/15 phút, cho một giọt parafin loãng lên bề mặt thạch ống nghiệm đã cấy. Mỗi nồng độ cấy vào 2 ống nghiệm. Làm nguội nhanh dưới vòi nước và ủ ấm ở nhiệt độ 37oC /24- 48 giờ.
Chú ý: Trước khi lấy mẫu nuôi cấy cần lắc nhẹ đều dịch mẫu để tránh sự đơng vón các tế bào vi khuẩn, nếu không kết quả đọc được sẽ thấp hơn số thực.
- Bước 3: Đọc kết quả
Đếm tất cả các khuẩn lạc to, tròn đen lớn hơn hay bằng 3 mm. Số vi khuẩn Clostridium trong 1 gram phân được tính bằng cơng thức:
B (số vi khuẩn Clostridium /1 gram phân)= A. 1/n Với A: số khuẩn lạc trong ống nghiệm
23
Hình 3.1. Khuẩn lạc Clostridium sinh H2S trong môi trường TSC
Sơ đồ 3.1. Quy trình đếm số lượng Clostridium Pha lỗng với NaCl 0,9% (nồng độ 10-1… 10-3) Pha loãng với NaCl 0,9% (nồng độ 10-1… 10-3)
TSC (Đun cách thủy 80oC/15 phút)
37oC (24 – 48 giờ)
Đếm số khuẩn lạc tròn, đen
Kết luận Phân
3.4.2. Chỉ tiêu theo dõi
Định lượng vi khuẩn Clostridium trong mẫu phân heo con theo mẹ tiêu chảy và bình thường với các chỉ tiêu:
– Tỷ lệ mẫu phân có Clostridium đếm được trong mẫu phân heo tiêu chảy và phân heo bình thường của 3 trại.
– Tỷ lệ mẫu phân có Clostridium ở các giai đoạn tuổi khác nhau: Từ 1 đến 10 ngày tuổi
Từ 11 đến 20 ngày tuổi Từ 21 đến 28 ngày tuổi
– Số lượng vi khuẩn Clostridium trung bình trong mẫu phân heo tiêu chảy và phân heo bình thường trong từng trại.
Ghi nhận sơ bộ tình hình các trại lấy mẫu. 3.4.3. Xử lý kết quả
Phương pháp xử lý:
25