Tương tự hợp chất DS-3, dữ kiện phổ 1
H-NMR và 13C-NMR cũng chứng
minh hợp chất DS-4 là một triterpenoid khung lupane. Trong phổ NMR một
chiều, 6 nhóm metyl có độ dịch chuyển hóa học lần lượt là H-23 (H 0,76)/C-23
(C 28,0), H-24 (H 0,96)/C-24 (C 15,4), H-25 (H 0,82)/C-25 (C 16,0), H-26
(H 1,07)/C-26 (C 16,1), H-27 (H 0,98)/C-27 (C 14,8), H-30 (H 1,68)/C-30 (C
19,1) tín hiệu doublet-doublet ở H 3,18 (dd, 5,0, 11,5) thuộc vể proton metin
của nhóm 3-CHOH cacbinol. Nhóm exo-metilene H2-29 được tìm thấy ở độ dịch
chuyển hóa học H 4,58 (dd, 2,0, 8,5) và H 4,68 (d, 2,0). Sự khác biệt giữa hợp
chất DS-3 và DS-4 được xác định rằng nhóm metyl ở vị trí cacbon C-28 của hợp
chất DS-3 được thay thế bởi nhóm hydroxyl metilene [H 3,34 (d, 10,5) và H
3,80 (dd, 1,5, 10,5)/ C 60,6] trong hợp chất DS-4 (Bảng 4). Cấu trúc hợp chất
này còn được khẳng định bởi dữ kiện phổ hai chiều HSQC và HMBC, tương tác [M-H2O+H]+
HMBC H-28/C-16, C-17 và C-22 cho phép xác định rằng nhóm hydroxyl metilene liên kết trực tiếp với cacbon C-17. So sánh với tài liệu tham khảo, hợp
chất DS-4 được xác định có tên là betulin [46-48], một triterpenoid được tìm
thấy ở nhiều lồi thực vật bậc cao với nhiều hoạt tính đặc biệt là hoạt tính chống tiểu đường [49].
Hình 33: Phổ 1
Hình 34: Phổ 13
3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CHO CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP
Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ban đầu cho cao chiết EtOAc và 4 hợp chất phân lập được, chúng tôi nhận thấy rằng cao chiết EtOAc và hai naphthoquinone
DS-1 (isodiospyrin) và DS-2 (8'-hydroxyisodiospyrin) có tác dụng lên các dịng
tế bào ung thư thử nghiệm, trong khi đó 2 triterpnoid DS-3 (lupeol) và DS-4
(betulin) lại thể hiện hoạt tính tốt trong phép thử ức chế enzyme alpha- glucosidase. Chính vì lý do này, cao chiết tổng EtOAc và 2 napthoquinone được dùng cho thí nghiệm gây độc tế bào, 2 triterpenoid cịn lại dùng cho thí nghiệm chống tiểu đường ức chế enzyme alpha-glucosidase.
3.2.1. Hoạt tính gây độc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC được dùng cho thí nghiệm này là ung thư biểu mô KB (human epidermic carcinoma) (CCL
-17TM), ung thư gan Hep-G2 (hepatocellular carcinoma) (HB - 8065TM), ung
thư phổi LU (human lung carcinoma) (HTB - 57TM) và ung thư vú MCF-7 (human breast carcinoma) (HTB - 22TM).
Phương pháp thử độ độc tế bào: Được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Như đã mô tả ở Chương 2, trong nghiên cứu này chúng tôi áp dụng phương pháp MTT cho việc đánh giá mức độ sống sót của 4 dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các mơi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác. Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 37°C, vô trùng tuyệt đối). Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính. Kết quả được trình bày ở Bảng 5.
Bảng 5: Kết quả gây độc tế bào ung thư của các hợp chất thử nghiệm STT Nồng độ Ph n trăm ức chế KB Hep-G2 Lu MCF7 Cao chiết EtOAc (µg/mL) 128 90,2 86,6 85,2 86,6 32 77,4 53,2 40,0 35,8 8 37,2 21,0 26,6 11,0 2 13,1 4,0 7,4 7,5 IC50 15,8±1,2 29,75±2,5 53,33±3,14 60,23±7,12 DS-1 MW=374 128 (µg/mL) 88,0 85,5 88,4 79,6 32 62,7 50,0 30,9 34,6 8 37,0 20,7 23,0 29,4 2 20,5 16,5 15,2 19,2 IC50 (µM) 20,48±1,5 32,0±2,32 65,1±4,0 66,13±4,15 DS-2 MW=390 128 (µg/mL) 88,6 90,4 92,02 84,5 32 82,3 81,7 77,0 50,0 8 79,6 50,0 33,5 34,2 2 46,5 43,0 14,1 24,0 IC50 (µM) 2,27±0.4 8,0±0.58 17,27±1,85 32,0±3,05 Ellipticine IC50 (µM) 1,26 1,56 1,67 2,19
Các hợp chất naphthoquinone từ chi Diospyros được biết đến như các tác nhân gây độc tế bào ung thư tiềm năng. Ví dụ điển hình như, plumbagin và 3,3'-
biplumbagin cho các giá trị IC50 lần lượt là 130,8 và 82,1 µM trong việc ức chế
sự phát triển dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 [50]. Trong thí nghiệm này,
cao chiết EtOAc từ lá cây Thị đài lá rộng thu hái tại Thanh Hóa cho giá trị IC50 ở
mức độ trung bình, lần lượt là 15,8±1,2 và 29,75±2,5 µg/mL trong việc ức chế hai dòng tế bào KB và Hep-G2, nhưng cho hoạt tính yếu đối với hai dịng tế bào
ung thư Lu và MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 53,33±3,14 và 60,23±7,12
µg/mL. Hợp chất DS-1 cho giá trị IC50 ở mức độ trung bình được tìm thấy với
hai dịng tế bào ung thư KB và Hep-G2 là 20,48±1,5 và 32,0±2,32 µM, nhưng
hoạt tính yếu với hai dòng tế bào ung thư còn lại với giá trị IC50 lần lượt là
65,1±4,0 và 66,13±4,15 µM. Đặc biệt hơn cả, hợp chất DS-2 cho kết quả tốt. Ở
nồng độ 128 µg/mL, hợp chất này ức chế sự phát triển cả 4 dòng tế bào ung thư
với giá trị phần trăm ức chế lớn hơn 84%. Naphtoquinone DS-2 cho giá trị IC50 mạnh là 2,27±0.4 µM đối với việc ức chế sự phát triển dịng tế bào ung thư biểu
mơ KB, và giá trị IC50 trong khoảng 8,0±0.58-32,0±3,05 µM đối với 3 dòng tế
bào ung thư thử nghiệm còn lại. Kết quả nghiên cứu này khá tương đồng nghiên
cứu về Thị Đợn - Diospyros undulata với hợp chất maritinone cho giá trị IC50
mạnh là 2,57 và 3,02 µM đối với việc ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư vú MCF7 [23]. Như vậy, kết quả nghiên cứu đưa ra kết quả khá tương đồng với các nghiên cứu về chi Thị.
Dựa trên kết quả luận văn chúng tôi đã xuất bản ra một bài báo: “Nguyen Thi Thu Ha, Pham Van Cuong, Nguyen Thanh Tra, Nguyen Van Tuyen, Le Thi
Tu Anh, Ba Thi Cham, Ha Huy Tung, Ninh The Son, Cytotoxic
naphthoquinones from Diospyros fleuryana leaves, Discovery Phytomedicine
3.2.2. Hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase
Enzyme alpha-glucosidase đóng vai trị quan trọng trong quá trình thủy phân carbohydrate tạo glucose trong cơ thể. Do đó, các chất ức chế alpha- glucosidase có thể làm chậm q trình giải phóng và hấp thụ glucose, qua đó khơng làm tăng đường huyết sau ăn. Dưới tác dụng của enzyme alpha- glucosidase cơ chất p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside bị phân cắt qua đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng.
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng.
Hai hợp chất triterpenoid DS-3 và DS-4 được pha loãng bằng DMSO
100% thành dải các nồng độ 256, 64, 16, 4, 1 mg/mL. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo. Các thành phần phản ứng bao gồm: Phosphate buffer 100 mM pH 6,8 (40 µL), alpha-glucosidase 0,4 U/mL (25 µL), mẫu thử (10 µL), p- nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM (25 µL).
Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm
được ủ ở nhiệt độ 37 ºC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3.
Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410
nm (A). Kết quả của thí nghiệm được trình bày ở Bảng 6. Kết quả cho thấy
tương đồng với hợp chất myricitrin cho phần trăm việc ức chế hoạt động của enzyme alpha-glucosidase lên đến 98,07%, so với chất tham khảo acarbose là 83,03% [29]. Trong khi một số chất ức chế a- glucosidase như Acarbose và Miglitol đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị tiểu đường type 2.
Bảng 6: Phần trăm ức chế enzyme alpha-glucosidase của các hợp chất thử nghiệm STT Nồng độ Ph n trăm ức chế DS-3 MW=427 256 (µg/mL) 89.0 64 77.5 16 58.3 4 44.78 1 32.8 IC50 (µg/mL) 9,14 IC50 (µM) 21,4±1,8 DS-4 MW=443 256 (µg/mL) 90.2 64 84.7 16 68.0 4 45.0 1 19.3 IC50 (µg/mL) 6,61 IC50 (µM) 14,9±0.92 Acarbose IC50 (µM) 248,06±15.52
Kết quả Bảng 6 cho thấy cả hai hợp chất triterpenoid đều cho kết quả tốt trong việc ức chế hoạt động của enzyme alpha-glucosidase. Ở nồng độ 256 µg/mL, cả DS-3 và DS-4 ức chế tới 90%, trong khi đó ở dải nồng độ thấp hơn 4
- 16 µg/mL, phần trăm ức chế của cả hai hợp chất cũng đạt trung bình 60%. Giá
trị IC50 của triterpenoid betulin DS-4 đạt 14,9±0.92 µM, so với giá trị này của
lupeol DS-3 là 21,4±1,8 µM. Điều này xác định rằng việc thay thế nhóm metyl ở
vị trí cacbon 17 trong hợp chất DS-3 bằng nhóm hydroxyl metilene trong hợp
chất DS-4 là ngun nhân chính cho sự khác nhau này. Ngồi ra, cả hai hợp chất thử nghiệm đều cho giá trị IC50 thấp hơn so với chất tham khảo acarbose (IC50 248,06±15.52 µM). Từ kết quả nghiên cứu này, định hướng cho việc sử dụng các hợp chất thuộc lớp chất triterpenoid từ chi Thị - Diospyros trong việc hỗ trợ phòng và điều trị bệnh tiểu đường.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Đã phân tách và xác định được cấu trúc hai hợp chất napthoquinone là isodiospyrin (DS-1) và 8'-hydroxyisodiospyrin (DS-2) và hai hợp chất triterpenoid là lupeol (DS-3) và betulin (DS-4) từ cao chiết EtOAc của cây Thị đài lá rộng.
Cao chiết EtOAc và hai hợp chất napthoquinone isodiospyrin và 8'-
hydroxyisodiospyrin có tác dụng ức chế gây độc tế bào ung thư, đặc biệt hợp
chất 8'-hydroxyisodiospyrin có hoạt tính tốt trên hai dòng tế bào ung thư KB
và Hep-G2 với giá trị IC50 lần lượt là 2,27±0.4và 8,0±0.58 µM.
Hai hợp chất triterpenoid lupeol và betulin kìm hãm tốt hoạt động của
enzyme alpha-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 21,4±1,8 và 14,9±0.92 µM. 4.2. KIẾN NGHỊ
Tiếp tục phân tách và xác định cấu trúc các hợp chất ở các phân đoạn còn lại của cao chiết EtOAc cũng như cao chiêt MeOH của lá cây Thị đài lá rộng.
Hai hợp chất triterpenoid DS-3 và DS-4 có khả năng ức chế sự hoạt động enzyme alpha-glucosidase, đem lại giá trị tiềm năng to lớn trong việc sử dụng các hợp chất này trong việc phòng và điều trị bệnh tiểu đường, cần tiếp tục có các nghiên cứu sâu hơn về mặt cơ chế tác dụng của chúng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abdur R, Ghias U, Seema P, Ajmal K, Sobia AH, Saud B, Khalid A, Naveed
M, Mohammad SM, Diospyros, an under-utilized, multi-purpose plant
genus: A review, Biomedicine & Pharmacotherapy, 91 (2017) 714-730.
2. Sinha BN, Bansal SK, A review of phytochemical and biological studies of
Diospyros species used in folklore medicine of Jharkhand, Journal of
Natural Remedies, 8 (2008) 11-17.
3. Chunyan X, Zhishen X, Xinjun X, Depo Y, Persimmon (Diospyros kaki L.)
leaves: a review on traditional uses, phytochemistry and pharmacological properties, Journal of Ethnopharmacology, 2 (2015) 229-240.
4. Shun WH, Jin WQ, Xue S, Pin YG, Ling ZL, Qing BL, Bei S, De LW, Shao
JS, Secoiridoids and lignans from the leaves of Diospyros kaki Thunb. with antioxidant and neuroprotective activities, Journal of Functional Foods, 24 (2016) 183-195.
5. Nathalie SJT, Carine MA, Gervais MH, Marcel F, Hans-Georg S, Beate N,
Bruno NL, Norbert S, Augustin EN, Antioxidant norbergenin derivatives
from the leaves of Diospyros gilletii De Wild (Ebenaceae), Phytochemistry
Letters, 36 (2020) 63-67
6. Cesari I, Hoerle M, Simoes-Pires C, Grisoli P, Queiroz EF, Dacarro C,
Marcourt L, Moundipa PF, Carrupt PA, Cuendet M, Caccialanza G, Wolfender JL, Brusotti G Anti-inflammatory, antimicrobial and antioxidant activities of Diospyros bipindensis (Gurke) extracts and its main constituents, Journal of Ethnopharmacology, 146 (2013) 264-270.
7. Trongsakul S, Panthong A, Kanjanapothi D, Taesotikul T, The analgesic,
antipyretic and anti-inflflammatory activity of Diospyros variegata Kruz,
8. Uddin G, Rauf A, Siddiqui BS, Muhammad N, Khan A, Shah SUA, Anti- nociceptive, anti-inflammatory and sedative activities of the extracts and
chemical constituents of Diospyros lotus L, Phytomedicine 21 (2014) 954-
959.
9. Baravalia Y, Kaneria M, Yaghasiya Y, Parekh J, Chanda S, Antioxidant and
antibacterial activity of Diospyros ebenum roxb. leaf extracts, Turkey
Journal of Biology, 33 (2009) 159-164.
10. Rao LR, Rao CS, SundarRaMaiah T, The chemical examination of
Diospyros species, Current Science, 35 (1966) 457-459.
11. Gupta RK, Mahadevan V, Chemical examination of the heartwood of
Diospyros ebenum, Indian Journal of Pharmacology, 29 (1967) 289-293.
12. Sidhu GS, Sankaram AV, Ali SM, Extractives from Diospyros species. 3.
New naphthaquinone and naphthols from heartwood of Diospyros
melanoxylon Roxb, Indian Journal of Chemistry 6 (1968) 681-685.
13. Lajubutu BA, Pinney RJ, Roberts MF, Odelola HA, Oso BA, Antibacterial activity of diosquinone and plumbagin from the root of Diospyros
mespiliformis (Hostch) (Ebenaceae), Phytotherapy Research, 9 (1995) 346-
350.
14. Ganapaty S, Steve Thomas P, Karagianis G, Waterman PG, Brun R,
Antiprotozoal and cytotoxic naphthalene derivatives from Diospyros
assimilis, Phytochemistry, 67 (2006) 1950-1956.
15. Cai L, Wei G.X., Van der Bijl P, Wu CD, Namibian chewing stick,
Diospyros lycioides, contains antibacterial compounds against oral
pathogens, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 48 (2000) 909-914. 16. Peyrat LA, Eparvier V, Eydoux C, Guillemot JC, Stien D, Litaudon M,
Chemical diversity and antiviral potential in the pantropical Diospyros genus, Fitoterapia 112 (2016) 9-15.
17. Hazra S, Ghosh S, Sarma DM, Sharma S, Das M, Saudagar P, Prajapati VK, Dubey VK, Sundar S, Hazra B, Evaluation of a diospyrin derivative as anti- leishmanial agent and potential modulator of ornithine decarboxylase of
Leishmania donovani, Experimental Parasitology. 135 (2013) 407-413.
18. Kameda K, Takaku T, Okuda H, Kimura Y, Inhibitory effects of various flavonoids isolated from enzyme activity leaves of Persimmon on angiotensin converting enzyme activity, Journal of Natural Products, 50 (1987) 680-683.
19. Belemtougri RG, Constantin B, Cognard C, Raymond G, Sawadogo L, Effects of two medicinal plants Psidium guajava L. (Myrtaceae) and Diospyros mespiliformis L. (Ebenaceae) leaf extracts on rat skeletal muscle cells in primary culture, Journal of Zhejiang University Science B, 7 (2006) 56-63.
20. Fatemeh F,Shaghayegh T,Vahid RA, Elham A,Hamid RS, Protective effect
of Diospyros kaki against glucose oxygen serum deprivation induced PC12
cells injury, Advances in Pharmacological and Pharmaceutical
Sciences, 2016 (2016) ID 3073078, 5 pages
21. Weijian B, Wenlie P, Linquan Z, Zhiyong X, Dehui H, Anlong X, Neuroprotective effects of a standardized extract of Diospyros kaki leaves on MCAO transient focal cerebral ischemic rats and cultured neurons injured by glutamate or hypoxia, Planta Medica, 73 (2007) 636-643.
22. Mainen JM, Pax JM, Ramadhani SON, Zakaria HM, Modest CK, Makuru M, Fikira K, Anticonvulsant activity of extracts of Diospyros Fischeri stem bark, African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4 (2007) 94-98.
23. Natcha PS, Nattawut S, Kwanjai K, Kitisak P, Panawan M, Somdej K, Two new naphthalenones from Diospyros undulata stem bark and their cytotoxic activity, Phytochemistry Letters, 24 (2018) 132-135.
24. Hyeonseok K, Gyuwonh H, Sang HJ, Hyukjoon K, Youngsic J, Young NP, Young JK, Diospyros kaki leaves inhibit HGF/Met signaling-mediated EMT and stemness features in hepatocellular carcinoma, Food and Chemical Toxicology, 142 (2020) 111475.
25. Sunil S, Mandeep K, Kenneth PM, Vladimir BB, Anti-cancer activities of diospyrin, its derivatives and analogues, European Journal of Medicinal Chemistry, 45 (2010) 3519-3530.
26. Samir D, Shalini J, Hariom Y. Exotic fruits as therapeutic complements for diabetes, obesity and metabolic syndrome, Food Research International, 47 (2011) 1856-1865.
27. Saikat D,Anup M, Ranabir S, Tarun KD, Vivekananda M, Effective control
of type 2 diabetes through antioxidant defense by edible fruits of Diospyros peregrina, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011 (2011) ID 675397, 7 pages.
28. Kyoung YL, Ju YJ, Mee YL, Dayoung J, Eun SC, Hwa YS, Diospyros blancoi attenuates asthmatic effects in a mouse model of airway inflammation, Inflammation, 35 (2012) 623-632.
29. Sang JK, Ji AK, Da HK, Seol HK, Kang YY, Seon J, Seon-Young K, SeungJ, Bio-assay guided isolation and identification of α-glucosidase inhibitors from the leaves of Diospyros lotus, Korean Journal of Pharmacognosy, 46 (2015) 105-108
30. Anil KS, Tek CS, Ruchi S, Pratibha P, Rajnish G, Mahesh CS, A novel compound lup-20 (29)-ene-3α,6β-diol identified in petroleum ether extract
of Diospyros melanoxylon Roxb. leaves and to reveal its antidiabetic activity in Rats, Pharmacognosy Magazine, 14 (2018) S245-S248.
31. Phạm Hoàng Hộ, Cây Cỏ Việt Nam, Nhà Xuất Bản Trẻ, Tập 1 (2003) 641- 659.
32. WWW.Caycanhhaidang.com/Cay Thi Canh.
33. Phạm Thị Ninh, Huỳnh Thị Kim Mỹ, Trần Thị Phương Thảo, Nghiên cứu thành phần hóa học của lá và vỏ cây thị (Diospyros decandra) thu hái tại tỉnh Hưng Yên, Việt Nam, Tạp Chí Hóa Học, 56 (2018) 65-69.
34. Lê Thị Xoan, Phí Thị Xuyên, Nguyễn Thị Thùy Dương, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of some Vietnamese medicinal plants, Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 62 (2020) 77-82.
35. Seru G, Pannakal Steve T, Serge F, Hartmut L Antitermitic quinones from
Diospyros sylvatica, Phytochemistry 65 (2004) 1265-1271.
36. Kunitoshi Y, Michiko T, Shinsaku N, Naphthoquinone derivatives from the