CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong
4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách
nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đơn chất hấp phụ lên cột, rót dung mơi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột.
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân
tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đơn chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà
áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.
2.3.3. Các phương lý h a và quang phổ xác định cấu trúc
Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý như điểm nóng cháy, độ quay cực
[α]D… với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối lượng (MS), các
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C-NMR và
DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập).
Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)
Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử
[M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng cơng thức phân tử [55].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thơng số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo [56].
Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký sẽ được
tiến hành đo phổ NMR. Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1
H- NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon
13
C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể
xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-
NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm
các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã được
xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HRMS [56].
2.3.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học
2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mơ, là dịng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.
- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
Phương pháp thử độ độc tế bào: Được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các mơi trường ni cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phơi bị (FBS) và các thành
phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng
tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dịng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính [57-58].
Nguyên lý của phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. Muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím
formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào [57-58].
Thử độc tế bào:
- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128, 32, 8, và 2 µg/ mL. Bổ
xung 190 µL dung dịch tế bào ở pha lỗng nồng độ 3 x 104 tế bào/mL vào mỗi
giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; mơi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200 µL dung
dịch tế bào 3x104
tế bào/ml. Ủ ở 37oC/ 5% CO2 trong 72h.
- Sau 72h thêm 10 µL MTT (5mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không
huyết thanh) và ủ tiếp ở 37 OC/4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc
đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ BIOTEK Epoch 2. Thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
IC: Phần trăm kìm hãm sự phát triển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát
2.3.4.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym alpha-glucosidase
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase được thực hiện trên đĩa 96 giếng với tổng thể tích phản ứng là 200 µL/giếng [59-62].
Nguyên lý của phương pháp:
Alpha-glucosidase là enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân carbohydrate tạo glucose trong cơ thể. Do đó, các chất ức chế alpha-glucosidase có thể làm chậm q trình giải phóng và hấp thụ glucose, qua đó khơng làm tăng đường huyết sau ăn. Vì vậy, một số chất ức chế alpha-glucosidase như acarbose và miglitol đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị tiểu đường type 2 [59-62].
Phương pháp dựa trên phản ứng phân cắt cơ chất p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranoside nhờ tác động của enzyme alpha-glucosidase, qua đó giải phóng sản phẩm là p-nitrophenol có màu vàng [59-62].
p-Nitrophenyl-α-D-Glucoside
α-Glucosidase
α-D-glucose + p-nitrophenol
Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng tại bước sóng 410 nm ở thời điểm 30 phút sau phản ứng, phản ánh lượng sản phẩm p-Nitrophenol sinh ra, qua đó phản ánh hoạt độ của enzyme alpha-glucosidase [59-62].
Thử ức chế enzyme alpha-glucosidase:
Mẫu thử được pha loãng bằng DMSO 100% hoặc nước cất vô trùng đến nồng độ cuối cùng trong phản ứng là 1024, 256, 64, 16, 4, 1 mg/mL. Acarbose được sử dụng làm chất tham khảo.
Các thành phần phản ứng bao gồm:
- Phosphate buffer 100 mM pH 6,8 : 40 µL
- Mẫu thử : 10 µL
- p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside 2,5 mM : 25 µL
Ở mẫu đối chứng âm, mẫu thử được thay bằng đệm phản ứng. Thí nghiệm
được ủ ở nhiệt độ 37 ºC. Sau 30 phút, phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3.
Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A).
Khả năng ức chế enzyme alpha-glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức:
( ) ( ) ( )
( )
IC50 (half maximal inhibitory concentration) là nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của enzyme a-glucosidase, được tính bằng phần mềm Table curve.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY THỊ ĐÀI LÁ RỘNG
3.1.1. Quy trình phân lập
Lá cây Thị đài lá rộng sau khi thu hái, được phơi trong bóng mát cho khơ tự nhiên. Mẫu được xay nhỏ (1,16 kg) và ngâm chiết với ethyl axetat (EtOAc)
bằng siêu âm trong 45 phút ở 45oC/3 lần, lọc lấy phần dịch và cất loại dung môi
dưới áp suất giảm thu được cao EtOAc (155,0 gram). Cao chiết này được phân tách sơ bộ trên cột silica gel (10 x 50 cm, 300.0 g) với hệ dung môi rửa giải là n-
hexan-aceton gradient (9:1→ 0:10, v/v) rồi đến hệ aceton-metanol gradient
(9:1→0:10, v/v), thu được 15 phân đoạn ký hiệu từ F1-F15. Tiến hành phân lập
sắc ký phân đoạn F2 (3.0 g) trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-
hexan-diclometan (9:1, v/v), thu được 7 phân đoạn nhỏ kí hiệu F21-F27. Phân đoạn F23 (113.0 mg) tiếp tục được phân lập sắc cột Sephadex với hệ dung môi
metanol-diclometan (9:1, v/v), thu được 3 phân đoạn nhỏ từ F231-F233. Phân
đoạn nhỏ F232 (30.0 mg) được tinh chế bằng sắc ký bản mỏng điều chế với hệ
dung môi 100% diclometan được chất DS-3 Lupeol (10.0 mg) kết tủa hình kim
màu trắng. Phân đoạn F3 (1.5 g) hòa trong dung môi diclometan thu được 2 phần là phần dịch F31 và phần tủa F32. Hòa tan F31 (0,15 g) bằng dung môi
metanol và đưa lên cột Sephadex với hệ dung môi metanol-diclometan (9:1,
v/v), thu được 3 phân đoạn, kí hiệu từ F311-F313. Hợp chất DS-1 Isodiospyrin
(5,0 mg) và DS-2 8'-Hydroxyisodiospyrin (6,0 mg) được phân lập từ phân đoạn
F312 (20.0 mg) bằng phương pháp sắc ký điều chế n-hexan-aceton (8:2, v/v).
Tương tự, tinh chế phân đoạn F313 (50,0 mg) bằng phương pháp điều chế bản mỏng với hệ n-hexan-aceton (8:2, v/v) ta thu được hợp chất DS-4 Betulin (11,0 mg) kết tủa tinh thể hình kim màu trắng, khơng hấp thụ UV. Quy trình phân lập được trình tóm tắt bởi sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Quy trình phân lập hóa học lá cây Thị đài lá rộng
Từ 1,16 kg bột lá cây Thị đài lá rộng như sơ đồ 1: Các hợp chất DS-1 (5,0 mg) tương ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,43%; DS-2 (6,0 mg) tương ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,52%; DS-3 (10,0 mg)tương ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,86%; DS-4 (11,0 mg) tương ứng với hiệu suất tách chiết từ bột lá là 0,95%.
Bột lá (1,16 kg)
DS-3 (10,0 mg) DS-4 (11,0 mg)
1, EtOAC, 45 oC, 3 lần x 45 phút 2, Cô quay thu hồi dung môi
DS-1 (5,0 mg)
Cao EtOAC (155,0 g)
DS-2 (6,0 mg)
1, Silica gel, n-hexan-aceton (9:1→ 0:10, v/v) 2, Silica gel, aceton-metanol (9:1→ 0:10, v/v)
F1 F2 (3,0 g) F3 (1,5 g) F4-F15 Silica gel n-hexan-CH2Cl2 (9:1, v/v) F21-F22 F23 (113,0 mg) F24-F27 Sephadex LH-20 CH3OH-CH2Cl2 (9:1, v/v) F231 F232 (30,0 mg) F233 Sắc ký điều chế TLC CH2Cl2 (100%) F32 (rắn) F31 (tan, 0,15 g)
Hòa tan trong CH2Cl2 (100%) Sephadex LH-20 CH3OH-CH2Cl2 (9:1, v/v) F311 F312 (20,0 mg) F313 (50,0 mg) Sắc ký điều chế TLC n-hexan-aceton (8:2)
3.1.2. Cấu trúc và dữ kiện phổ các hợp chất phân lập
Hình 13: Các hợp chất naphthoquione DS-1 và DS-2 và triterpenoid DS-
3 và DS-4 phân lập từ lá của loài Thị Đài lá rộng
Hợp chất DS-1: Isodiospyrin Bột màu vàng; 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 1. Hợp chất DS-2: 8'-Hydroxyisodiospyrin Bột màu đỏ; 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm) và 13C-NMR (125MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 2.
Hợp chất DS-3: Lupeol Tinh thể hình kim; đnc 208-210 o C; 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, H ppm) và 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, C ppm): Bảng 3. Hợp chất DS-4: Betulin Tinh thể hình kim; đnc 251-252 o C; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, H ppm) và 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, C ppm): Bảng 4.
3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được bằng phương pháp quang phổ
Hợp chất DS-1: Isodiospyrin
Hình 14: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-1
Hợp chất DS-1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng. Phân tích TLC
cho thấy hợp chất này có Rf = 0,4 (n-hexane-acetone, 3:1, v/v). Phổ HRESI-MS
(+) của hợp chất DS-1 xuất hiện peak ion giả phân tử m/z 357.0870 [M+H]+,
điều đó chứng minh rằng cơng thức phân tử của hợp chất DS-1 là C22H14O6. Phổ
1
H-NMR của hợp chất DS-1 cho phép xác định một naphthoquinone dạng dime (Bảng 1), bao gồm 4 proton thuộc kiểu hệ spin AB nằm trong 2 vòng quinone
[H-2 (H 6,94, J = 10,5 Hz), H-3 (H 6,92, J = 10,5 Hz); H-2' (H 6,72, J = 10,5
Hz), H-3' (H 6,94, J = 10,5 Hz)] và 2 proton thơm singlet ở độ dịch chuyển H-8
(H 7,61) và H-6' (H 7,30) thuộc về hai vịng phenyl. Phổ 1
tín hiệu singlet thuộc về 2 nhóm metyl [7-CH3 (H 2,01), 7'-CH3 (H 2,03)] và 2
nhóm hydroxyl [12-OH (H 12,05), 12'-OH (H 12,43)] liên kết trực tiếp với
vịng thơm: Hình 14. Bảng 1: Dữ kiện 1 H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất DS-1 STT DS-1 STT DS-1 C H (J, Hz) C H (J, Hz) 1 184,4 7' 148,2 1' 184,9 8 121,4 7,61 (s) 2 139,6 6,94 (d, 10,5) 8' 130,3 2' 140,1 6,72 (d, 10,5) 9 128,6 3 137,7 6,92 (d, 10,5) 9' 128,8 3' 138,8 6,94 (d, 10,5) 10 113,2 4 190,1 10' 114,2 4' 190,3 7-CH3 20,4 2,01 (s) 5 158,6 2'-CH3 5' 162,0 7'-CH3 20,6 2,03 (s) 6 135,1 5-OH 12,05 (s) 6' 125,7 7,30 (s) 5'-OH 12,43 (s) 7 145,5 8'-OH
Hình 15: Phổ HRESI-MS (+) của hợp chất DS-1
Hình 16: Phổ 1
H-NMR của hợp chất DS-1 [M+H]+
Phổ 13
C-NMR của hợp chất DS-1 xuất hiện tín hiệu của 5 cacbon metin
thơm trong vùng trường thấp C 121,4-140,1 ppm, 10 cacbon bậc bốn trong vùng
C 113,2-162,0 ppm, 4 cacbon cacbonyl C 184,4-190,3 ppm và 2 cacbon metyl
7-CH3 (H 20,4) và 7'-CH3 (H 20,6).
Hình 17: Phổ 13C-NMR của hợp chất DS-1
Cấu trúc của hợp chất DS-1 còn được chứng minh bởi phổ hai chiều
HSQC và HMBC (Hình 17,18). Hai hệ vịng quinone có các tương tác HMBC đặc trưng như H-3/C-1, C-2, C-4 và C-10, H-2'/C-1', C-9' và C-10', H-3'/C-1' và C-3'. Trên hệ vịng phenyl, 2 nhóm OH liên kết trực tiếp cacbon C-5 và C-5' với các tương tác HMBC 5-OH/C-5, C-6 và C-10, 5'-OH/C-5', C-6' và C-10', 2 nhóm metyl liên kết trực tiếp với cacbon C-7 và C-7' với các tương tác HMBC quan trọng như 7-CH3/C-6, C-7 và C-8, 7'-CH3/C-6' và C-7'. Hai proton singlet H-8 và H-6' có các tương tác HMBC đặc trưng như H-8/C-6 và C-10, H-8'/C-7' và C-10'. Tương tác HMBC 7'-CH3/C-6 xác định một cầu nối giữa hai cacbon C- 6 và C-8' của hai hệ vòng naphthoquinone. So sánh với tài liệu tham khảo chúng tơi xác định hợp chất DS-1 có tên là isodiospyrin [35-38].
Hình 18: Phổ HSQC của hợp chất DS-1
Hợp chất DS-2: 8'-Hydroxyisodiospyrin
Hình 20: Cấu trúc và các tương tác HMBC của hợp chất DS-2
Hợp chất DS-2 được phân lập dưới dạng bột màu đỏ. Phân tích TLC cho
thấy hợp chất này có Rf = 0,6 (n-hexane-acetone, 5:1, v/v). Tương tự hợp chất
DS-1, phổ 1
H-NMR cho phép xác định hợp chất DS-2 là một naphthoquinone
dạng dime (Bảng 2). Trong đó 4 proton doublet (J = 10 Hz) thuộc về 2 hệ spin AB tương ứng [hệ 1: H-2 (H 6,77), H-3 (H 6,94); hệ 2: H-6' (H 7,29), H-7' (H
7,28)]. Phổ 1H-NMR của hợp chất này cịn có sự xuất hiện 4 tín hiệu singlet
trong vùng trường thấp thuộc về 1 nhóm metin thơm H-6 (H 7,30), và 3 nhóm
OH [5-OH (H 12,34), 5'-OH (H 12,31) và 8'-OH (H 12,66)], cũng như 2 tín hiệu singlet nằm trong vùng trường cao thuộc về 2 nhóm metyl liên kết trực tiếp với nhân thơm [7-CH3 (H 2,19), 2'-CH3 (H 1,86)].
Bảng 2: Dữ kiện 1 H (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của hợp chất DS-2 STT DS-2 STT DS-2 C H (J, Hz) C H (J, Hz) 1 184,9 7' 129,7 7,28 (d, 10,0)