2.3.1. Các phương pháp ngâm chiết
Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dược liệu [53].
Hiện nay có hai phương pháp ngâm chiết phổ biến:
Phương pháp 1: Phương pháp ngâm chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu
sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để
phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu [53]. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: n-
Phương pháp 2: Phương pháp ngâm chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong duợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc ethanol (80-100%). Nhất là methanol được xem như là dung môi vạn năng, nó hòa tan được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh [53]. Ví dụ dãy dung môi: ether dầu, ether,
chloroform, ethyl acetate, n-buthanol.
Tiến hành:
Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu
trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (qui định riêng cho từng loại dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi).
Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc
ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ).
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn
giản, rẻ tiền.
Nhược điểm: Nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn:
năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu). Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu. Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.
Chiết ngâm lạnh: Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa. Sau khi chuẩn bị dược liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần [53].
Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một
cách mãnh liệt - gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất cần chiết xuất. Phương pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phương pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhưng có nhược điểm là chỉ áp dụng được với quy mô nhỏ [53].
2.3.2. Các phương pháp phân tích sắc ký
2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) thường là silica gel, aluminium oxit được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. và một pha chuyển động (pha động) bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [53].
Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa.
Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc.
Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
Giám sát các phản ứng hữu cơ.
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng và cho số liệu chính
xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC) [53].
Chuẩn bị sắc ký
Bản sắc ký được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một
lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc ký này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2 mm cho sắc ký lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc ký đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh [53]. Kỹ thuật
Phương pháp tiến hành giống với sắc ký giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc ký lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi.
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn
và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất
có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký (kết quả là hệ
số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc ký sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl axetat và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu
Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc ký. Thay đổi độ phân cực của
pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc ký. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc ký, một pha tĩnh không phân
cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
Phân tích
Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát
được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì
thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc ký vào,
hoặc phun lên bản sắc ký.
Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene florua (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối phổ.
Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác
định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc ký, và không phải là hằng số.
2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) [54]
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.
Chuẩn bị chất hấp phụ và cột: Silicagel phải được hoạt hóa ở 120°C trong 4 giờ trước khi đưa lên cột. Cột sắc ký phải là một khối đồng nhất, phải thật khô và lắp thẳng đứng trên một giá cố định vững chắc.
Nhồi cột: Chất hấp phụ phải được phân tán đồng đều trong cột. Có 2 cách nhồi cột: nhồi khô và nhồi ướt với dung môi. Sau khi đơn chất hấp phụ lên cột, rót dung môi vào cột và để chạy liên tục một thời gian để ổn định cột và không được để khô dung môi trong cột.
Đưa chất cần phân tách lên cột: Phải đưa chất lên cột sao cho chất phân tán thành một lớp mỏng đồng đều trên mặt cột bằng phẳng. Có nhiều cách đơn chất lên cột: phương pháp dùng đĩa giấy, cho thẳng dung dịch chất cần phân tách lên cột, trộn chất cần phân tách với một lượng chất hấp phụ…
Rửa cột: Tùy theo chất hấp phụ dùng và yêu cầu tốc độ chảy của cột mà áp dụng cách rửa cột bằng áp suất thường hoặc áp xuất nén. Hứng dịch chảy ra ở đáy cột theo phân đoạn, theo thời gian hoặc bằng ống nghiệm cùng thể tích.
2.3.3. Các phương lý h a và quang phổ xác định cấu trúc
Phương pháp chung để phân tích cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý như điểm nóng cháy, độ quay cực
[α]D… với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối lượng (MS), các
phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-NMR, 13C-NMR và
DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) được sử dụng để nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất được phân lập).
Phổ khối lượng (Mass spectrometry - MS)
Khối phổ là một trong các phương pháp thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của chất nghiên cứu dựa vào sự phát hiện ra ion phân tử
[M]+, [M+H]+…, từ đó giúp xây dựng công thức phân tử [55].
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ NMR là phương pháp hiện đại trong việc phân tích cấu trúc các hợp chất hóa học, dựa trên nguyên tắc cộng hưởng của các hạt nhân của các nguyên tử khi được đặt trong một từ trường. Trong phổ NMR có hai thông số có đặc trưng liên quan đến cấu trúc hóa học của một phân tử là độ dịch chuyển hóa học
δ và hằng số tương tác spin – spin J. Từ các dữ liệu phân tích các phổ 1D và 2D
NMR cho phép xây dựng cấu trúc phân tử của mẫu đo [56].
Các hợp chất sau khi được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký sẽ được
tiến hành đo phổ NMR. Trước tiên, các hợp chất sẽ được đo phổ proton 1
H- NMR. Nếu chất đảm bảo đủ độ tinh khiết sẽ được tiến hành đo tiếp phổ cacbon
13
C-NMR và DEPT. Với những hợp chất có cấu trúc đơn giản, hay gặp có thể
xác định được cấu trúc chỉ với số liệu cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1
H-
NMR, 13C-NMR và DEPT). Với các chất phức tạp hơn thì cần tiến hành đo thêm
các phổ NMR hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY), phổ IR, phổ X-ray để cung cấp thêm thông tin cho việc xác định cấu trúc. Hợp chất sau khi đã được
xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ đã nêu sẽ được khẳng định công thức phân tử dựa trên kết quả phổ MS hoặc phổ HRMS [56].
2.3.4. Các phương pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học
2.3.4.1. Phương pháp nghiên cứu tính gây độc tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm:
- KB (Human epidermic carcinoma), ung thư biểu mô, là dòng luôn luôn được sử dụng trong các phép thử độ độc tế bào.
- Hep-G2 (Hepatocellular carcinoma) - ung thư gan. - LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi.
- MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
Phương pháp thử độ độc tế bào: Được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm
hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ xung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành
phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37 oC, độ ẩm 98%, vô trùng
tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính [57-58].
Nguyên lý của phương pháp MTT:
Trong những năm gần đây, phương pháp tetrazolium (MTT) được sử dụng phổ biến. Muối tetrazolium được dùng để triển khai phép thử so màu, qua đó đánh giá về sự sống sót và khả năng phát triển của tế bào động vật. Nguyên lý của phép thử là vòng tetrazolium bám chặt vào ti thể của tế bào hoạt động, dưới tác dụng của enzym dehydrogenase, màu vàng của MTT biến đổi thành màu tím
formazan. Kết quả đọc trên máy quang phổ và có độ chính xác cao. Phương pháp được dùng để đo độ độc của chất nghiên cứu, khả năng phát triển và hoạt động của tế bào [57-58].
Thử độc tế bào:
- Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128, 32, 8, và 2 µg/ mL. Bổ
xung 190 µL dung dịch tế bào ở pha loãng nồng độ 3 x 104 tế bào/mL vào mỗi
giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM cho các dòng tế bào Hep-G2, MCF-7, KB; môi trường DMEM cho LU-1. Giếng điều khiển có 200 µL dung
dịch tế bào 3x104
tế bào/ml. Ủ ở 37oC/ 5% CO2 trong 72h.
- Sau 72h thêm 10 µL MTT (5mg/mL pha trong môi trường nuôi cấy không
huyết thanh) và ủ tiếp ở 37 OC/4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc
đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ BIOTEK Epoch 2. Thí nghiệm được lặp lại với n = 3.
IC: Phần trăm kìm hãm sự phát triển
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát