Từ lá và vỏ của loài cây Thị D. decandra thu hái tại Hưng Yên, Việt Nam.
Năm 2018 Phạm Thị Ninh và các cộng sự [33] đã tách và định lượng xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng các phương pháp quang phổ IR, MS và
NMR, các triterpenoid có khung lupan phân lập được gồm: 2Z-3,7,11,15,19- pentamethyleicos-2-en-1-ol, astragalin, β-sitosterol, daucosterol và bacosine.
Các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Thị đã và đang đem lại tiềm năng to lớn trong việc ứng dụng chúng vào phòng và điều trị bệnh tiểu
đưởng. Hợp chất triterpenoid mới trong thiên nhiên phân lập từ lá của loài D.
melanoxylon, có tên là lup-20 (29)-ene-3,6 β-diol, có tác dụng làm giảm tới 81,27 ±11.63 (mg/dl) lượng đường trong máu chuột bị tiểu đường gây ra bởi streptozotocin [30].
1.3.ỨNG DỤNG CỦA CHI THỊ - DIOSPYROS TRONG ỨC CHẾ TẾ BÀO
UNG THƯ VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH TIỂU ĐƯỜNG
1.3.1. Ứng dụng trong ức chế tế bào ung thư
Độc tính gây độc tế bào đối với các tế bào bình thường là không mong muốn, nhưng đối với các tế bào ác tính là một yêu cầu cần thiết để kiểm soát ung thư. Đối với vấn đề này, việc áp dụng cao chiết và các hợp chất phân lập từ
các loài thực vật trong chi Diospyros trong việc gây độc tế bào ung thư cho thấy
một số lợi ích.
Bằng việc quá trình lặp lại phân lập sắc ký cột cho cao chiết methanol của
thân cành loài D. undulata, bốn hợp chất plumbagin, isodiospyrin, maritinone,
3,3′-biplumbagin đã được phân tách được cho tác dụng chống lại sự phát triển
dòng tế bào ung thư MCF-7 với giá trị IC50 1,38 - 6,4 µM, so với chất đối chứng
dương IC50 11,8 µM [23].
Theo một nghiên cứu gần đây cao chiết ethanol của lá D. kaki có tác dụng
ngăn chặn rõ rệt sự di cư và xâm nhập của tế bào qua trung gian HGF thông qua việc điều hòa CDH1 và giảm SNAI1, VIM, MMP1, MMP2 và MMP9. Hơn nữa, cao chiết này làm tăng độc tính tế bào của sorafenib, vốn bị giảm bởi HGF, và giảm sự biểu hiện của các dấu hiệu thân cây KRT19 và CD44. Quan trọng hơn
cả, cao chiết này làm giảm hoạt động Met và làm giảm hoạt động của JNK/c-Jun qua trung gian HGF. Phát hiện này chứng minh rằng cao chiết ethanol cây Hồng có thể cải thiện HCC có tiên lượng xấu thông qua cách ngăn chặn tín hiệu HGF/Met [24]
1.3.2. Ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường
Proanthocyanidin là thành phần chính được phân lập từ vỏ hồng. Khi lớp chất này được sử dụng trong việc điều trị chuột bị tiểu đường do streptozotocin (STZ) gây nên, nó làm giảm peroxid hóa lipid, ức chế tạo ra các loại oxy phản ứng và làm giảm glucose huyết thanh, hemcosylated hemoglobin (HbA1C), protein tiết niệu, và các sản phẩm cuối glycation thận tiên tiến trong điều kiện tiểu đường [26].
Cao chiết methanol của quả cây D. peregrina làm giảm mức đường huyết ở
chuột mắc bệnh tiểu đường. Ngoài ra, cao chiết này còn có tác dụng làm giảm nồng độ các chất phản ứng lipid và thiobarbituric acid (TBARS) trong huyết thanh và cải thiện hoạt động của các enzyme chống oxy hóa như SOD, CAT và
GSH [27]. Tương tự, phân đoạn chiết có chứa epigallocatechin-3-O-gallate của
cây D. kaki được báo cáo là có hoạt tính hạ đường huyết của chuột [28].
Các hợp chất phân lập từ các loài thực vật trong chi Thị đã và đang đem lại tiềm năng to lớn trong việc ứng dụng chúng vào phòng và điều trị bệnh tiểu đưởng. Một ví dụ điển hình đến từ nghiên cứu của Sang et al (2015), trong 3 hợp
chất myricitrin, myricetin và caffeic acid phân lập từ lá loài D. lotus, thì hợp
chất myricitrin ức chế enzyme alpha-glucosidase lên đến 98,08% khi so sánh với chất đối chứng dương acarbose (83,03%) [29]. Tương tự, hợp chất triterpenoid
mới trong thiên nhiên phân lập từ lá của loài D. melanoxylon, có tên là
lup-20 (29)-ene-3,6 β-diol , có tác dụng làm giảm tới 81,27 ±11.63 (mg/dl)
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Lá cây Thị đài lá rộng được thu hái ở Ngọc Lạc-Thanh Hóa vào tháng 01 năm 2018. Mẫu tiêu bản được lưu giữ tại phòng Hóa sinh ứng dụng, viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Giám định thực vật bởi TS. Nguyễn Quốc Bình Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hình 10: Cây Thị đài lá rộng - Diospyros fleuryana A. Chev. ex Lecomte
2.2. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
Sắc ký bản mỏng TLC: Sử dụng bản mỏng nhôm tráng sẵn silica gel 60 F254
Merk, độ dày 0,2 mm. Sắc ký cột pha thường silica gel (0,040- 0,063 mm), sắc ký cột Sephadex LH-20
Bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại (Vilber) ở bước sóng 254 và 365
nm sau đó hiện màu bằng thuốc thử Ce(SO4)2, vanilin (Sigma).
Các dung môi như n-hexane, ethyl axetate, diclchoromethane, acetone và
methanol (hóa chất công nghiệp) đều được cất lại trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz với TMS (Tetra methyl silane) là chất chuẩn nội và được thực hiện do tại Viện Hóa Học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Môi trường nuôi cấy tế bào: môi trường DMEM (Dulbeccos Modified Eagle
Medium), các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC)
gồm Hep-G2 (HB - 8065TM), MCF-7 (HTB - 22TM), KB (CCL -17TM), LU-1 (HTB -
57TM), huyết thanh bò FBS (Merk).
Chất tham khảo ellipticine (Sigma) trong phép thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư, chất tham khảo acarbose (Sigma) trong phép thử hoạt tính ức chế enzyme alpha-glucosidase.
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170), tủ cấy sinh học an toàn cấp II, máy li tâm
(Universal 320R), kính hiển vi ngược (Zeizz), tủ lạnh sâu -250 oC, -800 oC,
buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ), máy quang phổ (BIOTEK), bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Các phương pháp ngâm chiết
Phương pháp chiết xuất là bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ và cách chiết. Vì vậy không thể có một phương pháp chiết xuất chung cho tất cả các dược liệu [53].
Hiện nay có hai phương pháp ngâm chiết phổ biến:
Phương pháp 1: Phương pháp ngâm chiết xuất nhằm mục đích nghiên cứu
sơ bộ khi chưa biết rõ thành phần hóa học của dược liệu, dùng phương pháp cổ điển là sử dụng một dãy dung môi từ không phân cực đến phân cực mạnh để
phân đoạn các hợp chất ra khỏi dược liệu [53]. Ví dụ: sử dụng dãy dung môi: n-
Phương pháp 2: Phương pháp ngâm chiết xuất khi cần chiết lấy toàn bộ thành phần trong duợc liệu thì dung môi thích hợp nhất methanol hoặc ethanol (80-100%). Nhất là methanol được xem như là dung môi vạn năng, nó hòa tan được chất không phân cực đồng thời cũng có khả năng tạo dây nối hydro với các nhóm phân cực khác. Dịch chiết với methanol thu được, đem loại hết dung môi thu được cao toàn phần chứa hầu hết hợp chất của dược liệu. Khi cần tách phân đoạn các hợp chất trong cao thì sử dụng dung môi không hòa lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh [53]. Ví dụ dãy dung môi: ether dầu, ether,
chloroform, ethyl acetate, n-buthanol.
Tiến hành:
Sau khi chuẩn bị dược liệu, người ta đổ dung môi cho ngập dược liệu
trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định (qui định riêng cho từng loại dược liệu), rút lấy dịch chiết (lọc hoặc gạn) và rửa dược liệu bằng một lượng dung môi thích hợp. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn bằng cánh khuấy hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi lại đổ lên trên (tuần hoàn cưỡng bức dung môi).
Có nhiều cách ngâm: Có thể ngâm tĩnh hoặc ngâm động, ngâm nóng hoặc
ngâm lạnh, ngâm một lần hoặc nhiều lần (còn gọi là ngâm phân đoạn hay ngâm nhiều mẻ).
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn
giản, rẻ tiền.
Nhược điểm: Nhược điểm chung của phương pháp chiết xuất gián đoạn:
năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu). Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu. Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.
Chiết ngâm lạnh: Là phương pháp đơn giản nhất và đã có từ thời cổ xưa. Sau khi chuẩn bị dược liệu, tiến hành đổ dung môi ngập dược liệu trong bình chiết xuất, sau một thời gian ngâm nhất định, rút lấy dịch chiết. Để tăng cường hiệu quả chiết xuất, có thể tiến hành khuấy trộn hoặc rút dịch chiết ở dưới rồi đổ lên trên. Có thể ngâm một lần hoặc nhiều lần [53].
Chiết bằng siêu âm: Sóng siêu âm gây ra sự phá vỡ cấu trúc vật lý một
cách mãnh liệt - gây ra sự khuyếch tán vào trong dung môi của các chất cần chiết xuất. Phương pháp siêu âm hiệu quả hơn và nhanh hơn phương pháp chiết xuất bằng ngâm lạnh nhưng có nhược điểm là chỉ áp dụng được với quy mô nhỏ [53].
2.3.2. Các phương pháp phân tích sắc ký
2.3.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng là một phương pháp phân tách lý - hóa trong đó các chất được tách ra khỏi một hỗn dựa trên sự “phân bố” liên tục của chúng giữa 2 pha, một pha không chuyển động (pha tĩnh) thường là silica gel, aluminium oxit được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. và một pha chuyển động (pha động) bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch [53].
Sắc ký lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực:
Xét nghiệm độ tinh khiết của các hóa chất phóng xạ trong dược khoa.
Xác định các sắc tố trong tế bào thực vật.
Phát hiện thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng trong thức ăn, hoặc.
Nhận biết những hóa chất trong một chất cho sẵn.
Giám sát các phản ứng hữu cơ.
Một số cải tiến có thể kết hợp phương pháp truyền thống để tự động hóa một vài bước, làm tăng độ dung giải của sắc ký lớp mỏng và cho số liệu chính
xác hơn. Phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (high performance TLC - HPTLC) [53].
Chuẩn bị sắc ký
Bản sắc ký được làm bằng cách trộn chất hấp phụ, như silica gel, với một
lượng nhỏ chất trơ để kết dính, như canxi sulfat (thạch cao), và nước. Hỗn hợp này được trải ra như một lớp vữa đặc trên một bề mặt chất trơ, như thủy tinh, nhôm, hoặc nhựa. Bản sắc ký này sẽ được để khô và kích hoạt bằng cách nung nóng trong lò trong 30 phút ở nhiệt độ 110 °C. Độ dày của lớp hấp phụ thường là 0.1-0.25 mm cho hóa học phân tích, và khoảng 1-2 mm cho sắc ký lớp mỏng dự bị. Trong mọi kĩ thuật sắc ký đều bao gồm 1 pha động và 1 pha tĩnh [53]. Kỹ thuật
Phương pháp tiến hành giống với sắc ký giấy với lợi thế là nhanh hơn, tách hỗn hợp hiệu quả hơn, và có sự lựa chọn giữa các "pha tĩnh" khác nhau. Bởi tính đơn giản và nhanh, sắc ký lớp mỏng thường được dùng để giám sát các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng.
Một vệt nhỏ dung dịch chứa mẫu thử được thấm lên bản sắc ký, khoảng 1 cm từ dưới lên. Bản sắc ký sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, như ethanol hoặc nước, và được đặt vào trong một vật chứa có nắp. Dung môi di chuyển lên bản sắc ký bởi mao dẫn, gặp phải mẫu thử và dịch chuyển mẫu thử lên bản sắc ký. Các hợp chất khác nhau trong hỗn hợp mẫu thử dịch chuyển với tốc độ khác nhau do chúng có sức hút khác nhau đối với pha tĩnh, và độ tan khác nhau trong dung môi.
Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có được chỗ liên kết với pha tĩnh. Thí dụ, nếu silica gel được dùng như pha tĩnh, nó được xem là phân cực. Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cực lớn hơn sẽ có sự liên kết với silica gel lớn hơn
và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động ra khỏi các chỗ liên kết. Do đó, hợp chất
có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao hơn trên bản sắc ký (kết quả là hệ
số lưu Rf sẽ lớn hơn). Nếu pha động được thay bằng một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng để đẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc ký sẽ dịch chuyển lên cao hơn. Trên thực tế, nếu chúng ta dùng một hỗn hợp ethyl axetat và heptane như là pha động, tăng thêm ethyl acetate sẽ cho hệ số lưu
Rf cao hơn cho tất cả các hợp chất trên bản sắc ký. Thay đổi độ phân cực của
pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyển ngược lại trên bản sắc ký. Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc ký, một pha tĩnh không phân
cực sẽ được sử dụng, như là C18-chức năng hóa silica.
Dung môi thích hợp dùng trong sắc ký lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cực khác với pha tĩnh. Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một pha tĩnh phân cực, vệt nhỏ mẫu thử sẽ lan tròn do mao dẫn, và các vệt khác nhau có thể trộn lẫn vào nhau. Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sử dụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnh phân cực, và ngược lại.
Phân tích
Do một số hóa chất khi được tách ra sẽ trở nên không màu, một vài phương pháp được sử dụng để quan sát những vệt này:
Thông thường, một lượng nhỏ chất huỳnh quang, thường là maganese-
activated zinc silicate, được cho thêm vào chất hấp phụ để có thể quan sát
được những vệt này dưới ánh sáng đen (tia cực tím UV254). Lớp hấp phụ vì
thế sẽ tự phát ra ánh sáng lục, nhưng các vệt mẫu sẽ làm tắt ánh sáng này.
Hơi Iodine cũng là một loại thuốc thử cho màu giống nhau.
Một số thuốc thử cho màu riêng biệt được dùng để nhúng bản sắc ký vào,
hoặc phun lên bản sắc ký.
Trong trường hợp của chất béo, sắc phổ có thể sẽ được chuyển qua một
màng polyvinylidene florua (PVDF) và sau đó sẽ được phân tích sâu hơn, chẳng hạn như khối phổ.
Một khi đã trở nên quan sát được, hệ số lưu Rf của mỗi vệt mẫu sẽ được xác
định bằng cách chia khoảng cách di chuyển được của hợp chất cho khoảng cách di chuyển được của dung môi. Những số liệu này phụ thuộc vào các loại dung môi được sử dụng và các loại bản sắc ký, và không phải là hằng số.
2.3.2.2. Phương pháp sắc ký cột (CC) [54]
Sắc ký cột là một dạng của sắc ký bản mỏng. Trong sắc ký cột, chất hấp phụ pha tĩnh được nhồi trong các ống hình trụ gọi là “cột”. Nhờ vậy mà có thể triển khai nhiều hệ dung môi khác nhau từ phân cực yếu đến mạnh. Giống như sắc ký lớp mỏng, phương pháp này cũng dựa vào độ phân cực của các chất, những chất có ái lực lớn hơn đối với chất hấp phụ sẽ ra khỏi cột chậm hơn và những chất có ái lực yếu hơn sẽ ra khỏi cột nhanh hơn trong 15 quá trình sắc ký. Sự tách trong cột xảy ra chủ yếu theo cơ chế hấp phụ hoặc phân bố tùy theo tính chất của chất được sử dụng làm cột.