Đây là phương pháp sử dụng khả năng thủy phân, lên men và phá vỡ cấu trúc
của một số loại vi khuẩn, nấm, vi sinh vật. Hiện nay người ta nghiên cứu sử dụng
một số loại nấm như Cyathus sp, Streptomyces viridosporus, Phelebia tremellosus, Pleurotus florida và Peurotus cornucopiae có khả năng thủy phân lignin và hỗ trợ
một phần thủy phân nguồn nguyên liệu celulose. Tuy nhiên, thời gian xử lý kéo dài cũng là một hạn chế lớn của phương pháp này. Theo Costa et al. 2002 và Crawford
et al. 1984, nghiên cứu sự thủy phân sinh khối lignocellulose khi sử dụng nấm nâu
và nấm trắng cho thấy sự phân hủy lignin hiệu quả, phát huy tác dụng thông qua sự
xúc tác của các enzyme phân giải lignin như enzyme peoidase và laccase yêu cầu năng lượng thấp nhưng lại bị mất cellulose khá nhiều dẫn đến năng suất thấp.
Tiền xử lý bằng nấm mục trắng đã được kết hợp tiền xử lý sử dụng dung môi
(SSF) từ các mảnh gỗ sồi (Itoh et al.2003). Kết quả từ các nghiên cứu gần đây cho
thấy rằng tiền xử lý bằng nấm đối với rơm cây lúa mì trong 10 ngày có khả năng
phân giải cao lignin và ít phân giải cellulsoe ( dòng nấm phân lập RCK-1) đã làm giảm lượng acid cho quá trình thủy phân, tăng mức độ giải phóng các đường có khả năng lên men và giảm nồng độ của các yếu tố ức chế lên men. Sản lượng và năng
suất thấp, ethanol thu được lần lược là 1,48 g/g và 0,54 g/L.h (Kuhar et al.2008). Nói chung những quy trình như vậy sẽ có lợi thế như chi phí thấp, tiêu hao
năng lượng ít, không đòi hỏi hóa chất, các điều kiện môi trường ít chặt chẽ. Tuy nhiên, trở ngại chính để phát triển các phương pháp sinh học là tốc độ thủy phân đạt được khá thấp ở hầu hết các nguyên liệu sinh học so với các công nghệ khác (Sun
và Cheng. 2002).