Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Giám sát quần thể vật chủ - vector
Bằng phương pháp điều tra, nghiên cứu động vật – côn trùng theo thường quy của tổ chứa Y tế Thế Giới (WHO) [Bahmanyar M., Cacanaugh D.C, et 1976; WHO - Plague Manual. Epidemiology, Distribution, Surveillance and Control, 1999]
nhằm:
- Thu thập và xột nghiệm chuột chết khụng rừ nguyờn nhõn.
- Theo dừi dịch hạch ở quần thể chuột nhạy cảm với dịch hạch.
- Đánh bẫy chuột để có các dữ liệu về quần thể, xét nghiệm mô và thu thập các loài ngoại ký sinh.
2.3.1.1 Thu thập chuột
Chuột chết: dùng kẹp gắp chuột cho vào túi vải, hoặc cho vào lọ thủy tinh có nút mang về phòng thí nghiệm.
Chuột sống: Đánh bẫy
Loại bẫy: bẫy lồng hoặc bẫy sập
Mồi nhử: trong bẫy cần bỏ vào các loại lương thực, thực phẩm để tăng độ hấp dẫn chuột vào bẫy như: tôm, tép, các loại cá khô nhỏ, cơm nguội…
Nơi đặt bẫy: có thể đặt bẫy vào một vị trí đặc trưng như kho chứa lương thực, thực phẩm, bụi rậm gần hang ổ chuột hoặc nơi mà có dấu hiệu chuột thường đi lại.
Cách đặt bẫy: Dùng bẫy lồng mắt lưới 1x1cm, đặt mỗi đêm 100 bẫy tại các hộ gia đình liên tiếp trong một khu vực dân cư (3 bẫy/1 hộ).
Thu chuột vào buổi sáng, dùng miệng túi vải trúm kín cửa lồng bẫy, dốc ngược lồng bẫy để đưa chuột vào túi thu, cột chặt miệng túi sau đó đưa về phòng thí nghiệm.
Mỗi đợt giám sát tại một địa phương cần tiến hành trong 3 đêm với số bẫy chuột tối thiểu phải từ 100 bẫy trở lên.
2.3.1.2 Thu thập bọ chét
Thu thập bọ chét từ chuột đánh bẫy
Trong trường hợp chuột còn sống, cần gây mê trước, sau đó đặt trong thau trắng có thành cao ít nhất là 20cm, dùng lược chải thật kỹ lên lông động vật. Nếu có bọ chét rơi xuống đáy thau thì thu thập bỏ vào lọ đã dán nhãn, để tránh cho xác bọ chét bị thối rữa nên cho xác bọ chét vòa lọc có chứa dung dịch alcohol hoặc nước muối 2‰, sau đó xác định loài, phân lập vi khuẩn và xét nghiệp khác.
Đối với chuột chết thì tìm kiếm bọ chét trực tiếp và cần đề phòng bọ chét rời bỏ chuột chết nhảy sang người hoặc ra phòng thí nghiệm.
Nếu có các vật liệu bằng vải, bông…đựng mẫu chuột thì cần chú ý thu thập bọ chét từ những vật liệu này.
Thu thập bọ chét tự do tại các địa điểm có chuột chết tự nhiên
Đặt khay nước trên mặt đất nơi phát hiện có chuột chết tự nhiện để thu thập điều tra bọ chét tự do.
2.3.2 Xác định thành phần loài vật chủ - vector
Phương pháp định loại chuột theo khóa định loại của Cao Văn Sung Viện Sinh thái tài nguyên.[Cao Văn Sung và Cs, 1980]
2.3.2.1 Thành phần loài vật chủ
Để định loại chuột dựa vào các đặc điểm:
a) Màu lông
- Phần lụng lưng và phần lụng bụng: phõn biệt rừ ràng hoặc khụng rừ ràng (trên đậm dưới nhạt).
- Nhóm lông có gai hoặc không có gai: Dùng tay vuốt ngược lông thân chuột có những sợi lông cứng, dựng đứng là nhóm lông gai.
- Màu lông đuôi: đuôi đồng màu, trên thẫm dưới nhạt, trên đậm dưới trắng…
b) Chiều dài thân
Được xác định từ lỗ hậu môn đến chóp mũi.
c) Chiều dài đuôi
Được đo từ lỗ hậu môn đến mút đuôi (không tính lông đuôi)
Xác định nhóm chuột có chiều dài đuôi ngắn hơn hay dài hơn chiều dài thân.
d) Chiều dài bàn chân sau
Đo từ gót bàn chân đến mút ngón chân giữa (không tính móng)
Vd: Chuột nhắt nhà chiều dài bàn chân khoảng 17mm, chuột cống khoảng 35-40mm, chuột lắt khoảng 20-22mm…
e) Chiều cao tai
Đo cạnh trong gốc tai đến đỉnh tai.
f) Công thức vú
2 đôi vú trên + 2 đôi vú dưới = 8 cái 2 đôi vú trên + 3 đôi vú dưới = 10 cái 3 đôi vú trên + 3 đôi vú dưới = 12 cái g) Cân nặng
Chuột nhắt cân nặng khoảng 10-15g; chuột lợn lớn khoảng 900- 1000g.
h) Phần phụ
Màu sắccặp răng trên và cặp răng dưới: màu trắng, màu vàng, màu nâu đỏ…
Màu sắc mặt bàn chân dưới: màu đen hoặc màu da bình thường…
2.3.2.2 Định loại bọ chét
Dựa vào các đặc điểm chủ yếu sau:
a) Răng lược
- Nhóm có răng lược gồm răng lược má, răng lược ngực như bọ chét chó mèo, bọ chét thảo nguyên…
- Nhóm không có răng lược (Xenosylla cheopis, Pulex irritans) ->
nhóm bọ chét mang mầm bệnh dịch hạch (nhóm nghiên cứu chủ yếu).
b) Vị trí lông mắt
- Lông mắt ở trước mắt: Xenosylla cheopis - Lông mắt ở dưới mắt: Pulex irritans c) Gờ kitin
- Nhóm có gờ kitin: Xenosylla cheopis - Nhóm không có gờ kitin: Pulex irritans
2.3.3 Xác định các chỉ số giám sát vật chủ - vector 2.3.3.1 Chỉ số phong phú về chuột thường sử dụng
Theo tổ chức Y tế Thế giới: chỉ số phong phú chung dưới 3% là bình thường.
Trên 7% là báo động và nếu trên 15% nghiêm trọng (nguy cơ xảy ra dịch).[WHO - Plague Manual. Epidemiology, Distribution, Surveillance and Control, 1999]
2.3.3.2 Các chỉ số bọ chét
Ở vùng dịch hạch lưu hành, nếu chỉ số bọ chét >1 được xem là nguy hiểm;
>1.5 là báo động và >4 là nghiêm trọng.[WHO - Plague Manual. Epidemiology, Distribution, Surveillance and Control, 1999]
2.3.4 Xét nghiệm vi sinh vật 2.3.4.1 Lấy mẫu bệnh phẩm
Từ chuột: mổ xác chuột lấy mảnh cắt gan, lách, phổi, hạch cho vào lọ thủy tinh gửi đến phòng thí nghiêm để làm các xét nghiệm vi sinh vật nhằm chuẩn đoán dương tính với bệnh dịch hạch. Các chai lọ chứa mẫu phải được bảo quản lạnh trong thời gian vận chuyển. Nếu ở xa phòng thí nghiệm, các phủ tạng của chuột cần đươc giữ trong môi trường vận chuyển Cary-Blair.
Từ bọ chét thu được trên chuột: lấy toàn thân bọ chét trong cối sứ với một ít nước muối NaCl 9‰ để nuôi cấy vi khuẩn.
2.3.4.2 Quan sát hình thái
Làm tiêu bản nhuộm Wayson: lấy mảnh cắt gan, lách, phổi chấm lên lam kính, cho 1 giọt thuốc nhuộm Wayson rồi để khô tự nhiên. Nhỏ vài giọt cồn 900 lên phiến đồ đã khô, để cồn bốc hơi nhẹ nhàng, phơi phô, soi dưới kính hiển vi vật kính 100 quan sát hình thái vi khuẩn Y.pestis: hình bầu dục nhỏ bắt màu xanh đậm ở hai đầu, rỗng ở giữa.
Công thức thuốc nhuộm Wayson (bảng phụ lục 1) 2.3.4.3 Nuôi cấy
Vi khuẩn dịch hạch mọc tốt ở 280C, là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện, dễ mọc trên những môi trường thông thường: thạch peptone, canh thang BHI, môi trường thạch DOC…
Cấy phủ tạng chuột, dịch nghiền bọ chét vào môi trường phân lập bằng cách chấm trực tiếp mãnh cắt phủ tạng chuột lên trên bề mặt môi trường.
- Ở môi trường thạch Deoxycholate Natri, sau 48 giờ ở nhiệt độ 280C khuẩn lạc mọc rất nhỏ thường hay liên kết với nhau thành từng vệt mờ, màu hồng nhạt, bờ gồ ghề, giữa có màu đỏ sẫm.
- Trên môi canh thang BHI sau 48 giờ, vi khuẩn lắng xuống đáy ống, một số ít đóng thành một lớp váng mỏng trên mặt canh thang, khẽ chạm sẽ rơi xuống đáy ống làm cho môi trường trở nên trong, lắc nhẹ vẩn đục cuộn lên từ đáy ống, đây chính là tính chất đặc trưng của vi khuẩn dịch hạch trong môi trường lỏng.