Chương 3 : Phương pháp nghiên cứu
3.2 Phương pháp
3.2.1 Nội dung 1: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh
hoa Cúc và các dòng thực khuẩn thể có khả năng kí sinh vi khuẩn gây bệnh ở một số tỉnh ĐBSCL và tỉnh Lâm Đồng
3.2.1.1 Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh
Mục tiêu: Phân lập các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh ở một số tỉnh
ĐBSCL và tỉnh Lâm Đồng nhằm tạo ra nguồn vi khuẩn phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
33
Phương pháp thu mẫu bệnh
Thực hiện thu mẫu bệnh và phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh được áp dụng theo Mehan & McDonald (1995) và Burgess et al. (2009).
Cách thu mẫu: Chọn thu 2 mẫu bệnh (đất + cây) mỗi ruộng Cúc ở những địa điểm khác nhau có triệu chứng héo xanh nhưng khơng q khơ, có mạch dẫn hóa nâu và khi cắt ngang thân quan sát có dịng dịch khuẩn màu trắng tn ra trong nước. Mẫu cây bệnh được đặt trong túi nilon riêng biệt, mẫu thu về cần phân lập vi khuẩn và TKT ngay trong ngày hoặc một ngày sau đó.
Phương pháp phân lập vi khuẩn
Mẫu bệnh được quan sát dưới kính hiển vi xác định có dịng tn vi khuẩn từ bó mạch hóa nâu trước khi đem phân lập trong đĩa petri.
Cách phân lập
1. Khử trùng bề mặt lam kính và dao lam, bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn
2. Dùng gòn thấm cồn 70% lau qua bề mặt thân Cúc để khử trùng.
3. Với dụng cụ đã được khử trùng nhẹ nhàng cắt một miếng nhỏ của vết bệnh dọc theo mạch dẫn hóa nâu khoảng 5mm2, sau đó cắt nhỏ mẫu bệnh. Rút 1-2 giọt nước cất thanh trùng nhỏ lên mẫu bệnh đã cắt. Đợi khoảng 1 phút cho vi khuẩn có đủ thời gian phân tán
vào giọt nước. Đưa vào kính hiển vi để quan sát dịng vi khuẩn tn ra trong giọt nước.
4. Dùng micropipette rút ra một giọt nhỏ vào rìa của đĩa petri chứa mơi trường King’s B 2% agar và dùng đũa cấy vi khuẩn đã khử trùng vạch giọt huyền phù vi khuẩn phân tán trên mặt đĩa (Hình 3.1)
Đĩa được ủ trong 48 giờ ở điều kiện phịng thí nghiệm. Quan sát hình thái
khuẩn lạc và chọn các đơn khuẩn lạc có màu trắng kem nhẵn bóng, trơn láng, hơi chảy, thực hiện phương pháp tách dòng để thu được vi khuẩn thuần (Burgess et al, 2009).
Hình 3.1: Hình minh họa đĩa cấy vi
khuẩn trên môi trường King’s B. (Nguồn: Burgess et al., 2009)
34
Cấy truyền khuẩn lạc đơn từ đĩa cấy tách dòng sang ống nghiệm chứa môi trường King’s B 2% agar, trữ làm nguồn để phân lập TKT và các thí nghiệm tiếp theo.
Cách đặt tên vi khuẩn: kí tự chữ là từ viết tắt tên tỉnh nơi mẫu của vi khuẩn
được thu, kí tự số là chỉ số dòng vi khuẩn thu thập được ở các tỉnh ĐBSCL và Lâm Đồng.
3.2.1.2 Phân lập các dòng thực khuẩn thể
Mục tiêu: Phân lập các dòng TKT ở một số tỉnh ĐBSCL và Lâm Đồng nhằm
tạo ra nguồn TKT ban đầu đa dạng về sinh học và thích ứng được điều kiện ở ĐBSCL.
Phương pháp thu mẫu: Mẫu đất và cây bệnh cùng địa điểm được dùng chung cho phân lập vi khuẩn gây bệnh và TKT.
Phương pháp phân lập thực khuẩn thể
Mẫu rễ, đất và thân cây bị bệnh được rửa sạch, lau khơ, sau đó được nghiền ra trong cối sứ. Phần tế bào thực vật sau khi nghiền được cho vào ống falcon đã thanh trùng cộng thêm 5mL nước cất đã thanh trùng, sau đó thực hiện ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/ phút trong 5 phút để loại bỏ tế bào thực vật. Thực hiện rút 1mL phần dịch trong của mỗi ống đã ly tâm vào ống eppendorf vơ trùng thêm vào 50µl chloroform/mL lắc đều bằng vortex để yên trong 5 phút để loại bỏ vi khuẩn, nấm, sau đó tiếp tục đem ly tâm 6000 vòng/ phút trong 5 phút để loại bỏ Chloroform. Cuối cùng dùng micropipette rút 700µl phần dịch trong chỉ chứa thực khuẩn thể vào ống eppendorf vô trùng khác, đem giữ trong điều kiện che tối ở nhiệt độ 4oC.
Rút 50μl dung dịch huyền phù chứa thực khuẩn thể cho vào đĩa Petri đã thanh trùng chứa môi trường King’s B agar đã nấu tan để nguội khoảng 50oC phối hợp với 100 μl huyền phù vi khuẩn phân lập từ mẫu bệnh tương ứng, hoà đều. Đĩa được ủ trong điều kiện phòng và quan sát sự hình thành các đốm thực khuẩn (plaques), đó là nơi vi khuẩn đã bị tiêu diệt bởi thực khuẩn thể. Thực hiện phương pháp tách dòng bằng cách chọn đốm thực khuẩn đơn lẻ và cấy truyền bằng tâm bông đã vô trùng sang đĩa petri mới chứa vi khuẩn ký chủ, sau 24 giờ thực khuẩn thể được thu hoạch bằng cách thêm vào 5mL nước cất vô trùng ngâm trong 30 phút, sau đó thu phần huyền phù chứa thực khuẩn thể. Thực hiện nhỏ ly tâm 2 lần kết hợp chloroform để loại bỏ vi khuẩn (như mơ tả ở phần trên), sau đó rút phần dung dịch trong bên trên chỉ chứa thực khuẩn thể qua ống eppendorf khác và trữ nguồn dùng cho thí nghiệm tiếp theo. Mẫu thực
35
khuẩn thể được trữ nguồn trong điều kiện che tối ở nhiệt độ 4oC (Nga & Tâm, 2014).
Cách đặt tên thực khuẩn thể
Các dịng thực khuẩn thể phân lập được kí hiệu là + tên tỉnh + số thứ tự (1,2,3,….). Trong đó: : ký hiệu TKT, kế đó là tên tỉnh (viết tắt và viết
hoa) nơi phân lập được TKT, phần số chỉ số dòng TKT thu thập được ở các tỉnh ĐBSCL.
Trong trường hợp, phân lập trực tiếp khơng có sự hiện diện TKT, thì mẫu sẽ được thực hiện phân lập theo phương pháp tăng sinh TKT
Phương pháp tăng sinh thực khuẩn thể
Bước 1: Nuôi tất cả các dòng vi khuẩn trên đĩa King’s B 2% agar trong 24 giờ.
Bước 2: Dùng đũa cấy vi khuẩn vít từng dịng vi khuẩn khác nhau cho vào ống falcon 50ml đã chứa 10mL môi trường King’s B lỏng, nuôi trên máy lắc ngang với vận tốc 100 vòng/phút trong 24 giờ.
Bước 3: Rút 100µl từng dịng thực khuẩn thể khác nhau vào 10mL mơi trường King’s B lỏng đã chứa vi khuẩn. Đặt dung dịch huyền phù đã chứa vi khuẩn và thực khuẩn thể trên máy lắc với vận tốc 100 vòng/phút trong 24 giờ.
Bước 4: Thực hiện ly tâm hai lần kết hợp Chloroform (như mô tả ở phần trên), sau đó rút phần dung dịch trong bên trên chỉ chứa thực khuẩn thể qua ống eppendorf khác và trữ nguồn ở điều kiện che tối ở nhiệt độ 4oC (Nga & Tâm, 2014).