Kết quả hình 3.1 cho thấy hợp chất baicalein có đỉnh hấp thụ cực đại tại 275,6 nm, hợp chất baicalin có đỉnh hấp thụ cực đại tại 277,6 nm và hợp chất chrysin có đỉnh hấp thụ cực đại tại 268,5 nm. Với mục tiêu định lượng đồng thời các hợp chất và tham khảo một số nghiên cứu, bước sóng 280 nm được lựa chọn để định lượng đồng thời baicalein, baicalin, chrysin trong dược liệu Hoàng bá nam [21].
3.1.1.2. Pha tĩnh
Qua các nghiên cứu trước đây, các tác giả chủ yếu lựa chọn cột pha đảo RP- HPLC để tiến hành định lượng các hoạt chất flavonoid trên. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tơi lựa chọn cột Ascentis C18 (15cm x 4,6mm, 5µm) để định
3.1.1.3. Khảo sát thành phần pha động
Để tiến hành khảo sát pha động chúng tôi tiến hành chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn có nồng độ các chất baicalein, baicalin, chrysin lần lượt là 210,4 - 6,575 µg/ml; 400 - 12,5 µg/ml; 100 - 3,125 µg/ml và dung dịch mẫu thử. Dung dịch mẫu thử được chuẩn bị với quy trình như sau:
Cân chính xác khoảng 0,5 g bột dược liệu Hoàng bá nam đã xay nhỏ vào bình cầu dung tích 250 ml. Thêm 40 ml EtOH. Chiết hồi lưu trong 30 phút. Để nguội, lọc dịch chiết vào bình định mức 50 ml. Tráng bã dược liệu bằng dung môi EtOH dịch tráng được chuyển lên giấy lọc vào bình định mức, bổ sung EtOH đến vạch định mức. Lọc dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µl thu được dung dịch tiêm sắc ký.
Các điều kiện sắc ký được giữ cố định như sau: Pha tĩnh: Cột Ascentis C18 (15cm x 4,6mm, 5µm)
Pha động: 0,1% acid formic trong nước (kênh A) và ACN ( Kênh B) Bước sóng phát hiện: 280 nm
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút. Nhiệt độ cột: 25oC
Tiến hành sắc ký từng dung dịch chuẩn đơn, dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử theo các chương trình sắc ký khảo sát như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Chương trình rửa giải gradient thử nghiệm
Hệ gradient 1 Hệ gradient 2 Thời gian (phút) Nước ( 0,1 % acid formic)
% ACN Thời gian (phút) Nước (0,1 % acid formic) % ACN 0,01 50 50 0,01 70 30 20 50 50 20 50 50 40 50 50 40 50 50 Hệ gradient 3 Thời gian (phút) Nước (0,1 % acid
formic) % MeOH
40 45 55
Qua tham khảo các nghiên cứu trước đây, các tác giả thường sử dụng hệ pha động ACN-nước (chứa acid phosphoric hoặc acid formic); MeOH-nước (chứa acid phosphoric hoặc acid formic). Khi đưa thêm acid formic vào pha động thì pic của các hợp chất phân tích sẽ thu gọn chân và cân đối. Mặc khác, với acid formic 0,1% giúp ngăn chặn sự ion hóa cho các hạt silica mà gây bất lợi cho cột, nên cột hoạt động tốt hơn. Kết hợp tham khảo các nghiên cứu trước, cho thấy acid formic được các tác giả sử dụng để phân tích bacalin, baicalein, chrysin. Do đó, acid formic được lựa chọn cho nghiên cứu định lượng đồng thời các flavonoid trong Hoàng bá nam. Với hệ pha động ACN- nước (0,1 % acid formic), thời gian lưu của từng chất được xác định bằng cách tiêm lần lượt từng chuẩn đơn vào hệ thống HPLC. Thứ tự rửa giải của từng chất là: baicalin → baicalein → chrysin. Sau đó tiêm lần lượt dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử để xác định khả năng tách của các chất khỏi nhau cũng như khỏi tạp chất khác trong nền mẫu. kết quả thu được như hình 3.2.
Hệ gradient 1
Baicalin
Hệ gradient 2
Hệ gradient 3