1: Bình chứa dung mơi pha động
2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp 4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò
7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.
8: In dữ liệu
Ứng dụng của phương pháp HPLC trong phân tích dược liệu
HPLC có thể phân tích rất nhiều các loại hợp chất khác nhau, từ chất phân cực tới không phân cực, từ các chất bay hơi đến các chất không bay hơi, từ các chất trung tính tới các chất điện ly. Tính linh hoạt của HPLC cũng cao hơn các phương pháp khác nhác nhờ cơ chế tách, pha động và pha tĩnh đa dạng. Với các ưu điểm đó, HPLC vẫn là lựa chọn ưu tiên trong phân tích dược liệu. Một số ứng dụng cụ thể của HPLC trong phân tích dược liệu như sau:
+ Định lượng riêng lẻ các chất trong hỗn hợp phức tạp của dịch chiết dược liệu khi so sánh diện tích pic với chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích.
+ Phân tích điểm chỉ các chất trong hỗn hợp nhằm xác định nguồn gốc xuất xứ của dược liệu, phân biệt dược liệu với các loài khác, xác định các nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu.
+ Phân lập, điều chế chất tinh khiết. Về nguyên tắc, HPLC điều chế hoạt động giống như HPLC phân tích. Khác nhau ở chỗ, cột sắc ký của hệ thống HPLC điều chế lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều hơn để có thể phân tích được nhiều mẫu hơn và các chất tách ra khỏi cột được thu lại để có chất tinh khiết.
2.3.1. Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn
Dung dịch đối chiếu baicalein (khoảng 1mg/ml): Cân chính xác khoảng 5,0 mg chất đối chiếu baicalein, hịa tan vào bình định mức 5 ml bằng dung mơi MeOH. Các dung dịch baicalein có nồng độ nhỏ hơn được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch 1mg/ml trong MeOH.
Dung dịch đối chiếu baicalin (1 mg/ml) và chrysin (1 mg/ml) chuẩn bị tương tự dung dịch chuẩn đối chiếu baicalein.
Dung dịch đối chiếu hỗn hợp: Từ dung dịch chuẩn 1 mg/ml, tiến hành pha loãng thành dãy dung dịch đối chiếu hỗn hợp. Các dung dịch 1mg/ml được bảo quản ở nhiệt đô 40C, sử dụng ổn định trong 2 tháng.
2.3.2. Tối ƣu hóa hệ thống phân tích sắc ký
2.3.2.1. Khảo sát điều kiện sắc ký:
Khảo sát bước sóng phát hiện: Xác định phổ UV của các hợp chất baicalein, baicalin và chrysin bằng máy quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS). Tiến hành đo từng dung dịch chuẩn đơn baicalein, baicalin và chrysin để xác định cực đại hấp thụ (λmax). Lựa chọn bước sóng tại vị trí cực đại hấp thụ làm bước sóng phát hiện.
Khảo sát chương trình pha động: Tiến hành khảo sát chương trình rửa giải gradient với pha động gồm acetonitril (kênh B), methanol (kênh D) phối hợp với nước (kênh A) theo các tỉ lệ khác nhau.
Các kết quả thu được với từng khảo sát được đánh giá, so sánh về thời gian lưu (tR), độ phân giải (Rs ) và hệ số đối xứng (As). Rs ≥ 1,5; As nằm trong khoảng
0,8 – 1,5 (tối ưu xấp xỉ bằng 1); tR của các chất phân tích khơng q dài nhưng đảm bảo tách xa nhau.
Tiến hành sắc ký dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn hỗn hợp trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC-UV để khảo sát điều kiện sắc ký.
2.3.2.2. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu
. Theo như tính chất đã biết của các flavonoid là tan tốt trong các dung môi hữu cơ như EtOH, MeOH, hỗn hợp MeOH/nước hoặc EtOH/nước. Dựa vào đặc điểm cấu trúc của hợp chất baicalin là một flavonoid có gắn một gốc đường nên hợp chất này sẽ tan tốt trong hỗn hợp dung mơi-nước. Trong khi đó, baicalein và chrysin là những hợp chất ít phân cực hơn. Chính vì vậy, các loại dung mơi chiết xuất dược liệu là: MeOH, MeOH 60%, MeOH 70%, MeOH 80%, EtOH, EtOH 80%, EtOH 70%, EtOH 60% được khảo sát nhằm tìm được dung mơi chiết xuất tối ưu nhất.
Có rất nhiều kỹ thuật chiết xuất khác nhau. Trong phịng thí nghiệm, một số phương pháp chiết xuất cổ điển thường được sử dụng ở quy mơ phân tích như: chiết Soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm…Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học cơng nghệ, có nhiều phương pháp chiết tiên tiến được sử dụng với mục đích giảm lượng dung mơi, hóa chất sử dụng để tránh độc hại và không gây ô nhiễm môi trường như: chiết pha rắn, chiết bằng chất lỏng quá tới hạn. Tuy nhiên các kỹ thuật này đều tương đối phức tạp và kinh phí tốn kém. Do đó, khó có thể áp dụng rộng rãi ở các đơn vị kiểm nghiệm. Theo các nghiên cứu trước định lượng baicalein, baicalin và chrysin đã công bố đều sử dụng phương pháp chiết là siêu âm và hồi lưu. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết hồi lưu và chiết siêu âm. Bên cạnh đó, nhằm tối ưu các điều kiện phân tích định lượng đồng thời ba hợp chất baicalein, baicalin và chrysin, chúng tối khảo sát các điều kiện về thời gian chiết mẫu, số lần chiết mẫu, từ đó lựa chọn được phương pháp xử lý mẫu. Đối với mẫu dược liệu Hồng bá nam, chúng tơi đưa ra quy trình dự kiến như sau:
Cân chính xác 0,5 g bột dược liệu hồng bá nam vào bình cầu 250 ml. Thêm 40 ml EtOH. Chiết hồi lưu trong thời gian là 30 phút, để nguội, lọc dịch chiết vào bình định mức 50 ml. Tráng bã dược liệu bằng dung môi EtOH, dịch tráng được
chuyển lên giấy lọc vào bình định mức, bổ sung EtOH đến vạch định mức. Lọc dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 µm thu được dung dịch tiêm sắc ký. Sơ đồ tóm tắt quy trình như sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1. Quy trình dự kiến xử lý mẫu dược liệu Hồng bá nam
2.4. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích
Sau khi khảo sát q trình xử lý mẫu và các điều kiện sắc ký, tiến hành thẩm định phương pháp định lượng đồng thời baicalin, baicalein và chrysin bằng HPLC- UV theo hướng dẫn của ICH [27] và có tham chiếu theo quy định của AOAC [15].
2.4.1. Tính chọn lọc, độ đặc hiệu
Tính chọn lọc của phương pháp là khả năng đánh giá một cách rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các thành phần khác như tạp chất hoặc các chất cản trở khác. Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, tính chọn lọc được thể hiện trên sắc ký đồ thu được từ mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn và mẫu trắng, pic của chất phân tích tách hồn tồn với các pic tạp. Trên sắc ký đồ mẫu trắng phải không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn.
Tiến hành chạy sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp baicalein, baicalin và chrysin, dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu thử thêm chuẩn, mẫu trắng EtOH 70% với chương trình đã lựa chọn.
Thời gian lưu của pic baicalein, baicalin và chrysin của dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu thử Hoàng bá nam, mẫu thử thêm chuẩn phải tương đương nhau, pic trong mẫu thử phải tách hoàn toàn với các pic khác trong nền mẫu.
2.4.2. Tính thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của tồn hệ thống phân tích bởi các yếu tố máy móc thiết bị.
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn đã chuẩn bị ở trên. Ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic. Tính tương thích hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD của các đáp ứng phân tích. Yêu cầu các giá trị thời gian lưu và diện tích pic có RSD ≤ 2 %.
2.4.3. Khoảng tuyến tính và đƣờng chuẩn
Khoảng tuyến tính
- Ý nghĩa: xác định được mối quan hệ tuyến tính giữa tín hiệu chất phân tích và nồng độ chất phân tích dưới dạng Y = a +b.X, trong đó Y là tín hiệu chất phân tích, X là nồng độ chất phân tích.
- Cách tiến hành: pha một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã nêu, lấy kết quả về diện tích pic và dựng đường chuẩn để thu được phương trình hồi quy. u cầu phương trình hồi quy có 0,99 ≤ R2 ≤ 1
- Đánh giá phương trình hồi quy:
Trong phương trình hồi quy y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a = 0 (khi khơng có chất phân tích thì khơng có tín hiệu). Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a ≠ 0. Nếu giá trị a khác ―0‖ có ý nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích cơng cụ cần kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và gia trị 0 có ý nghĩa thống kê khơng.
Cách kiểm tra: xây dựng các phương trình đường chuẩn trên phần mềm minitab 10. Từ đó tìm ra giá trị Pvalue của giá trị a. So sánh giá trị Pvalue với giá trị 0,05. Nếu Pvalue > 0,05 thì a ≠ 0 khơng có ý nghĩa thống kê, hay nói cách khác phương trình hồi quy không mắc sai số hệ thống [6].
2.4.4. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) của phƣơng pháp
- Giới hạn phát hiện của phương pháp (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được ( nhưng chưa thể định lượng được).
LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2-3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3.
- Giới hạn định lượng của phương pháp (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu đường nến, thơng thường lấy S/N = 10.
Trong đó: S: chiều cao tín hiệu của chất phân tích N: nhiễu đường nền.
Tiến hành pha loãng dung dịch thử đã xác định nồng độ đến nồng độ thấp nhất xác định được bằng sắc ký. Xác định tỷ lệ S/N.
2.4.5. Độ lặp lại trong ngày và khác ngày
- Ý nghĩa: độ lặp lại trong ngày chỉ độ chụm được thực hiện trong những điều kiện giống nhau, bởi cùng một kiểm nghiệm viên. Độ lặp lại khác ngày chỉ độ chụm được thực hiện bởi cùng một kiểm nghiệm viên, cùng một phịng thí nghiệm và được thực hiện trong 2 ngày khác nhau.
- Cách tiến hành: thực hiện 12 thí nghiệm trên cùng 1 mẫu phân tích trong 2 ngày khác nhau, theo quy trình xử lý mẫu giống nhau, trên cùng một thiết bị với điều kiện thực nghiệm. Các kết quả thu được dùng làm giá trị đánh giá về độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (% RSDr) và độ lệch chuẩn tái lặp tương đối (% RSDR).
2.4.6. Độ đúng (hiệu suất thu hồi)
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn. Tiến hành thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn tương ứng bằng 50%, 100% so với nồng độ đã định lượng được trong mẫu thực được lựa chọn (sao cho tổng hàm lượng và tín hiệu các chất phân tích thu được khơng bị vượt quá đường chuẩn). Hiệu suất thu hồi được tính bằng tỷ lệ phần trăm lượng lượng chất chuẩn thêm vào mẫu dược liệu và giá trị hàm lượng tìm lại được tính tốn từ kết quả đo.
2.4.7. Ƣớc lƣợng độ không đảm bảo đo(ĐKĐBĐ)
ĐKĐBĐ: Thể hiện sự tin cậy của các giá trị phân tích được của các chất phân tích. ĐKĐBĐ sẽ được thu thập từ tất cả các nguồn có thể gây sai số cho phép đo(lấy mẫu, xử lý mẫu, q trình phân tích mẫu,…)
Cách tiến hành: đối với các phép phân tích phức tạp, việc tính tốn và ước lượng ĐKĐBĐ dựa trên dữ liệu xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp trong phịng thí nghiệm. Cụ thể là dựa trên tính tốn về độ chụm và độ đúng.
+ Ước lượng ĐKĐBĐ liên quan đến độ chụm - độ lặp lại Us1
Us1= S1/(N)1/2 (1)
S
1: độ lệch chuẩn lặp lại; N: Số thí nghiệm
+ Ước lượng ĐKĐBĐ liên quan đến độ chụm - độ tái lặp Us2
Us2= S2/(N)1/2 (2)
S2: độ lệch chuẩn tái lặp; N: Số thí nghiệm + Ước lượng ĐKĐBĐ liên quan đến độ đúng:
UR(%) = tα,k x CVR(%); t0,05;2 =4,303 (3) CVR(%) = (SD/Htb) x 100% (4)
Trong đó: tα,k: giá trị student tra bảng với mức ý nghĩa α = 0,05;
số bậc tự do k = n – 1; CVR(%): hệ số biến thiên theo độ thu hồi (%); SD: Độ lệch chuẩn giữa các giá trị hiệu suất thu hồi; Htb: hiệu suất thu hồi trung bình.
UR = UR(%) x Ctb/100 (5)
Ctb: hàm lượng trung bình chất có trong mẫu (%/)
2.5. Phân tích mẫu thực tế
Mẫu thử sau khi được xử lý thu được dung dịch chạy sắc ký HPLC. Mỗi mẫu được phân tích lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Hàm lượng % của baicalin, baicalein và chrysin tính theo dược liệu khơ tuyệt đối được tính theo cơng thức:
(7) Trong đó
X(%): hàm lượng của baicalein, baicalin và chrysin tương ứng
C: nồng độ baicalein, baicalin hoặc chrysin tính theo phương trình đường chuẩn (µg/ml).
P: độ tinh khiết của chất chuẩn (%) m: khối lượng mẫu thử (mg)
CHƢƠNG III-KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời baicalein, baicalin, chrysin 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký
3.1.1.1. Khảo sát bước sóng hấp thụ cực đại của các chất nghiên cứu
Tiến hành xác định phổ UV-VIS của ba hợp chất baicalein, baicalin và chrysin. Hình 3.1 biểu diễn phổ UV-VIS của từng chất.
baicalein baicalin chrysin