Điều kiện 1 2
Hàm lượng baicalein (%) 0,720 ± 0,002 0,719 ± 0,001 Hàm lượng baicalin (%) 1,158 ± 0,003 1,158 ± 0,002 Hàm lượng chrysin (%) 0,270 ±0,001 0,271 ± 0,002 Nhận xét: Từ kết quả thu được cho thấy khi sử dụng điều kiện chiết 1 lần, chiết 2 lần thì hàm lượng baicalin, baicalein và chrysin trong dịch chiết thu được chênh lệch không đáng kể. Do đó lựa chọn chiết 1 lần với thời gian chiết là 30 phút là tối ưu cho phương pháp chiết.
3.1.3.4. Phương pháp định lượng đồng thời Baicalin, Baicalein, Chrysin bằng HPLC.
Sau quá trình khảo sát điều kiện phân tích bằng HPLC, điều kiện xử lý mẫu để định lượng đồng thời baicalein, baicalin, chrysin trong dược liệu Hoàng bá nam, phương pháp xử lý mẫu được đề xuất như sơ đồ 3.5
Mẫu thử (dạng bột mịn) 0,5 g
Chiết hồi lưu trong 30 phút, ở nhiệt độ 850C
Để nguội, lọc vào bình định mức 50 ml.Tráng bã dược liệu bằng EtOH 70%. Bổ sung đến vạch định mức
Dung dịch mẫu thử
Dung dịch mẫu thử dùng cho phân tích HPLC
Số liệu phân tích (giá trị diện tích pic)
+Chuyển vào bình cầudung tích 250 mL
+ Thêm 40 ml EtOH 70%
Lọc qua màng cellulose 0,45 µm
Cột C18 (15cm x 4,6mm, 5µm), Detector UV: 280 nm
Pha động: ACN-acid formic 0,1% Tốc độ dịng : 0,5 ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
Hàm lượng (%) baicalein, baicalin, chrysin trong mẫu thử
3.2. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp phân tích định lƣợng đồng thời baicalin, baicalein và chrysin trong dƣợc liệu hoàng bá nam.
3.2.1. Độ đặc hiệu (tính chọn lọc)
Đối với phân tích đồng thời baicalin, baicalein và chrysin, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch mẫu dược liệu Hoàng bá nam, dung dịch pha mẫu EtOH 70% với các điều kiện sắc ký và xử lý mẫu như đã nêu ở mục 3.1.2.5. Kết quả thu được như hình 3.6.
Hình 3.6. SKĐ HPLC-UV đánh giá tính đặc hiệu đối với baicalin, baicalein, chrysin
(1 - mẫu dung môi EtOH 70%, 2 - Dung dịch hỗn hợp chuẩn, 3 - Dung dịch mẫu thử, 4 - Dung dịch hỗn hợp thêm chuẩn)
Trên SKĐ thu được cho thấy, dung mơi pha mẫu khơng có pic đáp ứng tại thời gian lưu của baicalin, baicalein và chrysin chứng tỏ tín hiệu baicalin, baicalein, chrysin là đặc trưng, khơng bị trùng với các tín hiệu khác. Thời gian lưu của các pic baicalin, baicalein, chrysin ở các mẫu phân tích là tương đương nhau. Diện tích pic
chuẩn thêm vào so với diện tích pic baicalin, baicalein, chrysin trong mẫu thử. Kết quả thu được chứng tỏ phương pháp phân tích và hệ thống lựa chọn có tính đặc hiệu cao.
3.2.2. Tính thích hợp của hệ thống
Tính thích hợp của hệ thống được đánh giá thông qua giá trị RSD (%) của diện tích pic và thời gian lưu sau 6 lần phân tích lặp lại cùng một mẫu chuẩn baicalin nồng độ 40 µg/ml, baicalein 48 µg/ml và chrysin 40 µg/ml với điều kiện sắc ký đã khảo sát. Tiến hành ghi lại thời gian lưu và diện tích pic tương ứng. Kết quả thu được như