CHƢƠNG I : TỔNG QUAN
1.5. Phƣơng pháp thăm dị hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật kiểm định của
phối tử và phức chất.
Có nhiều phƣơng pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ tuy nhiên phƣơng pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và MCKane L., & Kendal (1996) đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất. Theo đó để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết đƣợc thực hiện trên các miếng vi lƣợng 96 giếng (96 – well microtiter plate). Theo phƣơng pháp này ngƣời ta thực hiện một số bƣớc nhƣ sau tiến. Các chủng vi sinh vật kiểm định sử dụng trong phƣơng pháp này là các vi sinh vật gây bệnh ở ngƣời đƣợc liệt kê trong bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các chủng vi sinh vật kiểm định
Vi khuẩn Nấm
Vi khuẩn Gram(-): Vi khuẩn Gram (+): Nấm sợi Nấm men Escherichia coli (ATCC 25922) Bacillus subtilis (ATCC 11774) Aspergillusniger (439) Candida albicans (ATCC 7754) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923) Staphylococcus aureus (ATCC 11632) Fusarium oxysporum (M42) Saccharomyces cervisiae (SH 20)
Hình 1.12: Phức chất của Pd(II) với bis(thiosemicacbazon) 2,5-hexanđion
Chứng dƣơng tính: Streptomycin cho vi khuẩn Gr (+), Tretracylin cho vi khuẩn Gr (-) Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men. Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin 50 mM; Tretracylin 10 mM; Nystatin 0,04 mM.
Chứng âm tính: Vi sinh vật khơng trộn kháng sinh và chất thử.
Các mẫu thử đƣợc tiến hành trong môi trƣờng nuôi cấy VSV- mơi trƣờng duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB) - Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trƣờng Trypease Soya Broth (TSB) – Sigma. Môi trƣờng tiến hành thí nghiệm là Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn và Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm. Sau khi chọn mơi trƣờng ni cấy và mơi trƣờng thí nghiệm thì các chủng kiểm định đƣợc hoạt hố và pha lỗng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm. Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 34oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men. Kết quả dƣơng tính là nồng độ mà ở đó khơng có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trƣờng thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5.
Sau khi tiến hành các thí nghiệm ta sẽ thu đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu (MIC – Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính: Các mẫu đã có hoạt tính đƣợc sàng lọc ban đầu đƣợc pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ (5 - 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó VSV bị ức chế phát triển gần nhƣ hoàn toàn.