1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU PHỨC CHẤT
1.4.1. Phương phỏp phổ hấp thụ hồng ngoại (IR)
Khi hấp thụ những bức xạ trong vựng hồng ngoại, năng lượng phõn tử tăng lờn 8 - 40 kJ/mol. Đõy chớnh là khoảng năng lượng tương ứng với tần số của dao động biến dạng và dao động quay của cỏc liờn kết trong hợp chất. Sự hấp thụ xảy ra khi tần số của bức xạ của tia tới bằng với tần số dao động riờng của một liờn kết nào đú trong phõn tử. Tần số dao động riờng của cỏc liờn kết trong phõn tử được tớnh theo cụng thức:
1 k 2 C Trong đú: à: Khối lượng rỳt gọn, à = m1m2/(m1+m2).
k: Hằng số lực tương tỏc, phụ thuộc bản chất liờn kết. C: Tốc độ ỏnh sỏng C = 3.1010 cm/s.
ν: Tần số dao động riờng của liờn kết.
Như vậy, mỗi liờn kết cú một tần số dao động riờng xỏc định, phụ thuộc vào bản chất cỏc nguyờn tố tham gia liờn kết và mụi trường mà liờn kết đú tồn tại. Khi tham gia tạo liờn kết phối trớ với cỏc ion kim loại cỏc dải hấp thụ của nhúm đang xột sẽ bị chuyển dịch về vị trớ hay thay đổi về cường độ. Từ sự dịch chuyển về vị trớ hay sự thay đổi về cường độ của cỏc dải hấp thụ cú thể thu được một số thơng tin về mơ hỡnh tạo phức của phối tử đó cho.
Bảng 1.1- Cỏc dải hấp thụ thụ chớnh trong phổ hấp thụ hồng ngoại của thiosemicacbazit i cm1 Quy kết i cm1 Quy kết 1 3380 as(N4H2) 8 1545 (CN4) 2 3350 as(N1H2) 9 1490 (HNC,HNN) 3 3290 s(N4H2) 10 1420 as(CNN) 4 3210 s(N1H2) 11 1320 s(CNN) 5 1600 (NH) 12 1295 as(NNH) 6 1650 (HN4H) 13 1018 as(HN4C) 7 1628 (HN1 H) 14 810 (CS)
Phổ hấp thụ hồng ngoại đó được sớm sử dụng trong việc nghiờn cứu cỏc thiosemicacbazon cũng như phức chất của chỳng với cỏc kim loại chuyển tiếp. Tuy nhiờn, do cấu tạo phức tạp của hợp chất thiosemicacbazon mà cỏc tớnh tốn lý thuyết để đưa ra cỏc quy kết cụ thể cịn gặp nhiều khú khăn. Chớnh vỡ vậy, việc quy kết cỏc dải hấp thụ trong phõn tử và trong phức chất của chỳng cũn chủ yếu dựa vào phương phỏp gần đỳng dao động nhúm. Trong cỏc tài liệu khỏc nhau [3, 5, 23], đều cú chung nhận xột dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hoỏ trị của nhúm C = S thay đổi trong một khoảng rộng từ 750 - 900 cm1 và dải này cú xu hướng giảm cường độ và dịch chuyển về phớa tần số thấp hơn khi tham gia tạo phức. Trong quỏ trỡnh tạo phức, nếu xảy ra sự thiol hoỏ thỡ dải hấp thụ đặc trưng cho dao động của nhúm CNN thường xuất hiện trong khoảng từ 1300 đến 1400 - 1500cm1.
Trong cỏc tài liệu khỏc nhau [1, 4, 7], đều cú chung nhận xột dải hấp thụ đặc trưng cho dao động hố trị của nhúm C = S thay đổi trong một khoảng rộng từ 805 - 830 cm1 và dải này cú xu hướng giảm cường độ và dịch chuyển về phớa tần số thấp hơn khi tham gia tạo phức. Đặc biệt [7] cho rằng, trong phổ hấp thụ hồng ngoại của cỏc hợp chất chứa lưu huỳnh cú thể gỏn dải ở 1050 - 1200 cm-1 cho dao động húa trị của nhúm C = S. Trong q trỡnh tạo phức, nếu xảy ra sự thiol hố thỡ dải hấp thụ đặc trưng cho dao động của nhúm CNN thường dịch chuyển về phớa tần số cao hơn, và xuất hiện trong khoảng từ 1300 đến 1500 cm1 như trong phức chất của thiosemicacbazon salixylanđehit, isatin, axetyl axeton với Cu2+
, Ni2+, Co3+...
1.4.2. Phương phỏp phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H
Phương phỏp phổ cộng hưởng từ hạt nhõn là một trong những phương phỏp hiện đại nhất được ứng dụng để xỏc định cấu trỳc của cỏc hợp chất hữu cơ.
Một hạt nhõn cú spin (I) khỏc khụng khi được đặt trong từ trường thỡ nú cú thể chiếm (2I + 1) mức năng lượng khỏc nhau. Sự chờnh lệch giữa cỏc mức năng lượng ấy phụ thuộc vào cường độ từ trường xung quanh hạt nhõn đú. Từ trường này là từ trường ngoài cộng với từ trường ngược chiều gõy ra bởi sự chuyển động của lớp vỏ điện tử xung quanh hạt nhõn. Như vậy, hiệu mức năng lượng của hạt nhõn từ
khụng những phụ thuộc vào từ truờng ngoài mà cịn phụ thuộc vào chớnh lớp vỏ điện tử xung quanh hạt nhõn ấy. Điều này dẫn tới cỏc hạt nhõn khỏc nhau đặt trong từ trường ngoài sẽ cần cỏc năng lượng khỏc nhau để thay đổi mức năng lượng của mỡnh. Trong phương phỏp cộng hưởng từ hạt nhõn, năng lượng kớch thớch cỏc hạt nhõn gõy ra bởi một từ trường biến đổi cú tần số tương đương với tần số súng vơ tuyến. Bằng cỏch thay đổi tần số của từ trường kớch thớch, ta sẽ thu được cỏc tớn hiệu cộng hưởng của cỏc hạt nhõn từ khỏc nhau trong phõn tử và cú thể xỏc định một cỏch cụ thể cấu trỳc của cỏc hợp chất hoỏ học.
Cỏc phõn tử thiosemicacbazon và phức chất của chỳng đều khơng cú nhiều proton nờn việc quy kết cỏc pic trong phổ 1
H - NMR tương đối dễ dàng. Thụng thường, proton cú mặt trong cỏc nhúm OH, NH - hiđrazin, NH - amit, CH = N và SH; đụi lỳc cú thờm proton của cỏc nhúm NH2, CH3, C6H5 và CH2. Trong phổ cộng hưởng từ proton của NH - hiđrazin cho tớn hiệu cộng hưởng ở khoảng 11,5 ppm, proton ở liờn kết đụi HC=N ở vựng gần 8,3 ppm và proton của OH ở khoảng 10 ppm.
1.4.3. Phương phỏp phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C
Phương phỏp cộng hưởng 13C bổ trợ cho việc nghiờn cứu cấu tạo của phối tử và phức chất vỡ số lượng cỏc nguyờn tử C trong chỳng cũng khụng nhiều.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C cho cỏc tớn hiệu của cỏc loại C. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ở những dạng thường như 13C - CPD hay DEPT, tương tỏc spin - spin C – C hay C – H đó được khử, nờn khụng cú sự tỏch vạch như trong phổ cộng hưởng từ hạt nhõn proton [7].
Dung mụi dựng trong phổ cộng hưởng từ hạt nhõn khụng được chứa những hạt nhõn cú tớn hiệu che lấp tớn hiệu chớnh. Thường được sử dụng là cỏc dung mụi đó bị đơterri húa như CCl4, CDCl3, CD2Cl2, CD3OD, CD3COCD3, D2O, DMSO - d6... Trờn phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ln cú tớn hiệu của cacbon của dung mụi. Dung mụi thường được dựng trong ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhõn của thiosemicacbazon và phức chất của nú là DMSO hoặc CDCl . Trong phổ cộng
hưởng từ hạt nhõn người ta quan tõm nhiều đến độ chuyển dịch húa học của cỏc proton hay cacbon. Cỏc nghiờn cứu [23], [19], [44] đó chỉ ra rằng tớn hiệu cộng hưởng của proton nhúm CH3 thường xuất hiện với cỏc pic sắc nột, độ chuyển dịch húa học trong khoảng 1 - 3 ppm, cỏc tớn hiệu cộng hưởng trong vũng pyriđin xuất hiện trong khoảng từ 5 - 8 ppm. Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C, tớn hiệu cộng hưởng của cacbon nhúm CS thay đổi khơng đỏng kể khi chuyển từ phối tử tự do vào phức chất, thường trong khoảng 175 ppm. Tớn hiệu cộng hưởng của cacbon nhúm C = N lại thay đổi nhiều, khi chuyển từ phối tử vào phức chất [23], [31]. Trong phối tử, cacbon nhúm này cộng hưởng trong khoảng 140 ppm cũn trong phức chất cacbon này cộng hưởng ở khoảng 150 ppm. Cacbon trong vũng pyriđin thường cộng hưởng trong khoảng 110 - 130 ppm trong phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C của thiosemicacbazon và thường thay đổi khụng đỏng kể khi chuyển từ phối tử tự do vào phức chất]. Tớn hiệu cộng hưởng của cacbon gốc metyl thường xuất hiện trong khoảng 30 ppm.
1.4.4. Phương phỏp phổ khối lượng
Phương phỏp phổ khối là phương phỏp khỏ hiện đại và quan trọng trong việc xỏc định một cỏch định tớnh và định lượng thành phần cũng như cấu trỳc của cỏc hợp chất hoỏ học. Ưu điểm nổi bật của phương phỏp này là cú độ nhạy cao, cho phộp xỏc định chớnh xỏc phõn tử khối của cỏc hợp chất.
Cơ sở của phương phỏp phổ khối lượng đối với cỏc chất hữu cơ là sự bắn phỏ cỏc phõn tử hợp chất hữu cơ trung hoà bằng cỏc phõn tử mang năng lượng cao để biến chỳng thành cỏc ion phõn tử mang điện tớch dương hoặc phỏ vỡ thành cỏc mảnh ion, cỏc gốc. Tuỳ thuộc vào cấu tạo và tớnh chất của chất nghiờn cứu mà người ta chọn phương phỏp bắn phỏ và năng lượng bắn phỏ thớch hợp.
Hiện nay, trong phương phỏp phổ khối người ta thường ỏp dụng cỏc phương phỏp ion hoỏ khỏc nhau như: ion hoỏ hoỏ học (CI), ion hoỏ bằng phương phỏp bụi electron (ESI), bắn phỏ bằng nguyờn tử tăng tốc (FAB), phun mự electron dựng khớ trợ giỳp (PAESI)… Cỏc phương phỏp này đều cú những ưu và nhược điểm riờng.
Tuy nhiờn, trong số cỏc phương phỏp trờn, phương phỏp bụi electron phự hợp nhất và được sử dụng để nghiờn cứu cỏc phức chất của kim loại. Ưu điểm của phương phỏp này là năng lượng ion hoỏ thấp do đú khơng phỏ vỡ hết cỏc liờn kết phối trớ giữa kim loại và phối tử. Dựa vào phổ khối lượng cú thể thu được cỏc thơng tin khỏc nhau như: khối lượng phõn tử chất nghiờn cứu, cỏc mảnh ion phõn tử, tỉ lệ cỏc pic đồng vị. Từ cỏc thơng tin này cú thể xỏc định được cụng thức phõn tử của phức chất và cấu tạo của phức chất dựa vào việc giả thiết sơ đồ phõn mảnh.
Cỏc phức chất nghiờn cứu đều chứa cỏc nguyờn tố cú nhiều đồng vị nờn pic ion phõn tử sẽ tồn tại dưới dạng một cụm pic của cỏc đồng vị, cường độ của mỗi pic đồng vị sẽ tỉ lệ thuận với xỏc suất kết hợp của một bộ cỏc đồng vị của cỏc nguyờn tố cú trong phõn tử. Cường độ tương đối giữa cỏc pic trong cụm pic đồng vị cũng cho ta thụng tin để xỏc nhận thành phần phõn tử hợp chất nghiờn cứu. Muốn vậy, người ta đưa ra cụng thức phõn tử giả định của hợp chất nghiờn cứu. Tớnh tốn lý thuyết cường độ tương đối của cỏc pic đồng vị sau đú so sỏnh với cường độ của cỏc pic trong phổ thực nghiệm để suy ra sự tương quan tỷ lệ cỏc pic đồng vị theo thực tế và theo lý thuyết từ đú khẳng định cơng thức phõn tử phức chất giả định. Việc tớnh toỏn lý thuyết được thực hiện bằng cỏch sử dụng phần mềm tớnh tốn trờn website:
http://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm (Isotope Distribution Calculator online).
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1.1. Phương phỏp nghiờn cứu 2.1.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Để xỏc định cụng thức phõn tử của cỏc phức chất tổng hợp được trong luận văn này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp phổ khối lượng.
Cấu tạo của cỏc phức chất và cỏch phối trớ của cỏc phối tử tổng hợp được nghiờn cứu bằng cỏch sử dụng cỏc phương phỏp phổ hiện đại như: Phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C và phổ hấp thụ electron.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc phối tử và phức chất tạo ra đều được thử để tỡm kiếm cỏc chất cú hoạt tớnh sinh học cao cú thể làm đối tượng nghiờn cứu ứng dụng trong y học và dược học. Đỏnh giỏ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm qua chỉ số IC50 và MIC.
2.1.2. Húa chất
Cỏc húa chất được sử dụng trong tổng hợp đều là cỏc húa chất tinh khiết.
STT Tờn húa chất Trạng thỏi tập hợp Xuất sứ
1 N(4) - metylthiosemicacbazit Rắn Merk (Đức)
2 2 - axetylpyriđin Lỏng Merk (Đức)
3 PdCl2 Rắn Anh
4 NiCl2.6H2O Rắn Trung Quốc
5 ZnCl2 Rắn Trung Quốc
Một số húa chất dựng làm dung mụi hay chất chỉ thị được sử dụng đều là cỏc húa chất tinh khiết dựng trong phõn tớch của Trung Quốc. Cỏc dụng cụ thớ nghiệm
và quỏ trỡnh tổng hợp được thực hiện tại phịng thớ nghiệm Húa sinh vơ cơ, Bộ mơn Húa vơ cơ - Khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.3. Kỹ thuật thực nghiệm
2.1.3.1. Cỏc điều kiện ghi phổ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc phức chất và phối tử được ghi trờn mỏy quang phổ IRAffinity – 1S của hóng Shimadzu trong vựng từ 4000 - 400 cm-1
tại Bộ mơn Hố Vơ cơ - Khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn - Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR) 1H và 13C được ghi trờn mỏy Avance - 500 MHz (Bruker) ở 300 K, trong dung mụi DMSO, tần số ghi phổ cộng hưởng từ proton là 500 MHz, tần số ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ở 125 MHz tại Viện Hoỏ học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được ghi trờn mỏy Varian MS 320 3Q - Ion Trap theo phương phỏp ESI tại Phịng cấu trỳc - Viện Hố học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Dung mụi được sử dụng là DMF, điều kiện ghi mẫu: vựng đo m/z : 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khụ 8 lit/ph; nhiệt độ làm khụ 325oC; tốc độ khớ 0,4 ml/ph; chế độ đo possitive.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất được thử tại Phũng thử hoạt tớnh sinh học - Viện Cụng nghệ Sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Thăm dũ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và cỏc phức chất
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trờn phương phỏp pha loóng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được ỏp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Đõy là phương phỏp thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đỏnh giỏ mức độ khỏng khuẩn mạnh yếu của cỏc mẫu thử thụng qua cỏc giỏ trị thể hiện hoạt tớnh là MIC
(nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định gồm cỏc vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở người:
Vi khuẩn Gr (+):
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường khụng gõy bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thương, vết bỏng,
gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lờn men cú ớch, thường cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của người và động vật.
Vi khuẩn Gr (-) :
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đường tiờu hoỏ như viờm dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm
trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đường tiết niệu, viờm màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thương hàn, nhiễm trựng đường ruột ở người và động vật.
Nấm men:
- Candida albicans: là nấm men, thường gõy bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và cỏc bệnh
phụ khoa.
Mụi trường nuụi cấy vi sinh vật: Mơi trường duy trỡ và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong mụi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma.
Mơi trường thớ nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Mẫu ban đầu được pha loóng trong DMSO (Đimethyl sulfoxide) và nước cất vụ trựng thành một dóy 05 nồng độ thớch hợp theo yờu cầu và mục đớch thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 g/ml, tiếp theo là 32 g/ml, 8 g/ml, 2 g/ml, 0,5 g/ml.
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo cỏc nồng độ đó được pha loóng, thờm 200
l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37o
C. Sau 24h, đọc giỏ trị MIC bằng mắt thường. Giỏ trị MIC được xỏc định tại giếng cú nồng độ chất thử thấp nhất gõy ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của vi sinh vật. Giỏ trị IC50 được tớnh tốn dựa trờn số liệu đo độ đục tế bào bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
2.2. TỔNG HỢP PHỐI TỬ VÀ PHỨC CHẤT
2.2.1. Tổng hợp phối tử Hmthapyr
Ở điều kiện thường thiosemicacbazit chỉ ngưng tụ với 1 phõn tử hợp chất