CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM
2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU VÀ KỸ THUẬT THỰC
2.1.1. Phương phỏp nghiờn cứu
Để xỏc định cụng thức phõn tử của cỏc phức chất tổng hợp được trong luận văn này, chỳng tụi sử dụng phương phỏp phổ khối lượng.
Cấu tạo của cỏc phức chất và cỏch phối trớ của cỏc phối tử tổng hợp được nghiờn cứu bằng cỏch sử dụng cỏc phương phỏp phổ hiện đại như: Phổ hấp thụ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 1H và 13C và phổ hấp thụ electron.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc phối tử và phức chất tạo ra đều được thử để tỡm kiếm cỏc chất cú hoạt tớnh sinh học cao cú thể làm đối tượng nghiờn cứu ứng dụng trong y học và dược học. Đỏnh giỏ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm qua chỉ số IC50 và MIC.
2.1.2. Húa chất
Cỏc húa chất được sử dụng trong tổng hợp đều là cỏc húa chất tinh khiết.
STT Tờn húa chất Trạng thỏi tập hợp Xuất sứ
1 N(4) - metylthiosemicacbazit Rắn Merk (Đức)
2 2 - axetylpyriđin Lỏng Merk (Đức)
3 PdCl2 Rắn Anh
4 NiCl2.6H2O Rắn Trung Quốc
5 ZnCl2 Rắn Trung Quốc
Một số húa chất dựng làm dung mụi hay chất chỉ thị được sử dụng đều là cỏc húa chất tinh khiết dựng trong phõn tớch của Trung Quốc. Cỏc dụng cụ thớ nghiệm
và quỏ trỡnh tổng hợp được thực hiện tại phịng thớ nghiệm Húa sinh vơ cơ, Bộ mơn Húa vơ cơ - Khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn - Đại học Quốc gia Hà Nội.
2.1.3. Kỹ thuật thực nghiệm
2.1.3.1. Cỏc điều kiện ghi phổ
Phổ hấp thụ hồng ngoại (IR) của cỏc phức chất và phối tử được ghi trờn mỏy quang phổ IRAffinity – 1S của hóng Shimadzu trong vựng từ 4000 - 400 cm-1
tại Bộ mơn Hố Vơ cơ - Khoa Húa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiờn - Đại học Quốc gia Hà Nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR) 1H và 13C được ghi trờn mỏy Avance - 500 MHz (Bruker) ở 300 K, trong dung mụi DMSO, tần số ghi phổ cộng hưởng từ proton là 500 MHz, tần số ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhõn 13C ở 125 MHz tại Viện Hoỏ học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
Phổ khối lượng (MS) được ghi trờn mỏy Varian MS 320 3Q - Ion Trap theo phương phỏp ESI tại Phịng cấu trỳc - Viện Hố học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam. Dung mụi được sử dụng là DMF, điều kiện ghi mẫu: vựng đo m/z : 50 - 2000; ỏp suất phun mự 30 psi; tốc độ khớ làm khụ 8 lit/ph; nhiệt độ làm khụ 325oC; tốc độ khớ 0,4 ml/ph; chế độ đo possitive.
Hoạt tớnh sinh học của cỏc hợp chất được thử tại Phũng thử hoạt tớnh sinh học - Viện Cụng nghệ Sinh học - Viện Hàn lõm Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.1.3.2. Thăm dũ khả năng khỏng khuẩn, khỏng nấm của cỏc phối tử và cỏc phức chất
Hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trờn phương phỏp pha loóng đa nồng độ của Vanden Bergher và Vlietlinck hiện đang được ỏp dụng tại trường Đại học Dược, Đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ. Đõy là phương phỏp thử hoạt tớnh khỏng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đỏnh giỏ mức độ khỏng khuẩn mạnh yếu của cỏc mẫu thử thụng qua cỏc giỏ trị thể hiện hoạt tớnh là MIC
(nồng độ ức chế tối thiểu), IC50 (nồng độ ức chế 50%) và MBC (nồng độ diệt khuẩn tối thiểu).
Cỏc chủng vi sinh vật kiểm định gồm cỏc vi khuẩn và nấm kiểm định gõy bệnh ở người:
Vi khuẩn Gr (+):
- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường khụng gõy bệnh. - Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gõy mủ cỏc vết thương, vết bỏng,
gõy viờm họng, nhiễm trựng cú mủ trờn da và cỏc cơ quan nội tạng.
- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lờn men cú ớch, thường cú mặt trong hệ tiờu hoỏ của người và động vật.
Vi khuẩn Gr (-) :
- Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gõy một số bệnh về đường tiờu hoỏ như viờm dạ dày, viờm đại tràng, viờm ruột, viờm lỵ trực khuẩn.
- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gõy nhiễm
trựng huyết, cỏc nhiễm trựng ở da và niờm mạc, gõy viờm đường tiết niệu, viờm màng nóo, màng trong tim, viờm ruột.
- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (-), vi khuẩn gõy bệnh thương hàn, nhiễm trựng đường ruột ở người và động vật.
Nấm men:
- Candida albicans: là nấm men, thường gõy bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và cỏc bệnh
phụ khoa.
Mụi trường nuụi cấy vi sinh vật: Mơi trường duy trỡ và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong mụi trường Trypcase Soya Broth (TSB)-Sigma.
Mơi trường thớ nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Mẫu ban đầu được pha loóng trong DMSO (Đimethyl sulfoxide) và nước cất vụ trựng thành một dóy 05 nồng độ thớch hợp theo yờu cầu và mục đớch thử. Nồng độ thử cao nhất là 128 g/ml, tiếp theo là 32 g/ml, 8 g/ml, 2 g/ml, 0,5 g/ml.
Lấy 10 l dung dịch mẫu thử theo cỏc nồng độ đó được pha loóng, thờm 200
l dung dịch vi khuẩn và nấm, ủ ở 37o
C. Sau 24h, đọc giỏ trị MIC bằng mắt thường. Giỏ trị MIC được xỏc định tại giếng cú nồng độ chất thử thấp nhất gõy ức chế hoàn toàn sự phỏt triển của vi sinh vật. Giỏ trị IC50 được tớnh tốn dựa trờn số liệu đo độ đục tế bào bằng mỏy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.