3.1. CẢI BIẾN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA PHYTASE
3.1.2. Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCR
Trong nghiên cứu này, chúng tơi cải biến trình tự gen của nấm mốc A. niger
CNTP 5131 (P12) nhằm nâng cao tính bền nhiệt của phytase tái tổ hợp. Cơ sở để thực hiện việc tạo đột biến xuất phát từ một nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007), 4 axit amin của A. fumigatus sẽ đƣợc thay thế vào vị trí tƣơng ứng của A. niger (A58E, P65S, Q191R, T271R) có thể tăng độ bền nhiệt của phytase nhƣng đồng thời khơng ảnh hƣởng đến đặc tính pH [73].
Hình 3.1. Mơ tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA.
Để thực hiện thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng vector pPICZαA/phyA/P12 mang gen mã hóa phytase tƣơng đối bền nhiệt của A. niger CNTP 5131 làm gen gốc. Các vị trí mã hóa axit amin số 58, 65, 191, 271 sẽ đƣợc thay thế bằng Glutamic axit (E58), Serine (S65), Arginine (R191), Arginine (R271) bằng phƣơng pháp đột biến điểm Mega-PCR. Các mồi PCR đƣợc thiết kế phù hợp với trình tự gen phytase CNTP 5131-P12 (PhyA) và mang đột biến mong muốn. Sơ đồ thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ Hình 3.1.
Bƣớc đầu tiên, chúng tơi tiến hành tạo hai mồi kích thƣớc lớn: Mega-A58E5 và Mega-T271R bằng phản ứng PCR sử dụng hai cặp mồi phyA-EcoRI-F, A58E5- R và T271R-F, phyA-XbaI-R2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau: 95ºC: 5 phút; (95 ºC: 30 s, 52 ºC: 20 s, 72 ºC: 50 s) × 25; 72 ºC: 10 phút, 4 ºC: ∞. Kết quả điện di cho thấy, chúng tôi đã khuếch đại đƣợc hai đoạn gen mang hai đột biến điểm A58E5 (Mega-1 ~170 bp, Hình 3.2-A, giếng 1) và T271R (Meg-4 ~ 545 bp, Hình 3.2-A, giếng 2).
A B M
Hình 3.2. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-A: sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi: phyA-EcoRI-F, A58E5-R; 2-A: Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi: T271R-F, phyA-XbaI-R2; 1-B: sản phẩm Mega-PCR cặp mồi A58E5, T271R.
Hai đoạn DNA này đƣợc cắt chính xác và tinh chế bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction (Thermo scientific) theo quy trình đã mơ tả trong phần 2.2.2 nhằm loại bỏ toàn bộ các thành phần dƣ thừa của phản ứng PCR. Sản phẩm DNA tinh sạch thu đƣợc dùng để làm mồi Mega trong phản ứng Mega-PCR lần 1 tạo đoạn gen phyA mang hai đột biến thay thế axit amin A58 và T271 ở hai đầu gen. Vì kích thƣớc của cặp mồi Mega là khá lớn nên nhiệt độ gắn mồi theo lý thuyết của chúng là rất cao. Do vậy, chúng tôi đã đƣa nhiệt độ gắn mồi lên bằng nhiệt độ kéo dài chuỗi và phản ứng trong vòng 2,5 phút mỗi chu kỳ. Kết quả trên hình 3.2-B cho thấy, sản phẩm
Mega-PCR cịn chứa nhiều khn và mồi Mega, đoạn gen đích có kích thƣớc khoảng 1,3 kb (giếng 1). Vì vậy chúng tơi tiến hành cắt gel và tinh chế đoạn DNA 1,3 kb để làm khuôn cho phản ứng Mega-PCR tiếp theo.
Sản phầm DNA mang hai đột biến sau tinh chế đƣợc sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR tạo hai mồi Mega tiếp theo. Hai cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm này mang 4 đột biến điểm là: (phyA-EcoRI-F, P65S-R) và (Q191R-F, phyA-XbaI-R2). Sau phản ứng PCR, đoạn DNA P65S (Mega-primer 2 ~195 bp, Hình 3.3-A, giếng 1) chứa hai đột biến điểm ở vị trí 170 và 195 trong gen phyA và đoạn DNA Q191R (Mega-primer 3 ~ 785 bp, Hình 3.3-A, giếng 2) chứa hai đột biến điểm ở vị trí 573 và 813 trong gen phyA.
A B M
Hình 3.3. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1%
trong đệm TAE ×0.5; M-Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-A: P65S Mega-primer sau tinh chế; 2-A: Q195R Mega-primer sau tinh chế; 1-B: Sản phẩm Mega-PCR lần 2.
Sản phẩm PCR đƣợc tinh chế, sau đó dùng làm mồi Mega cho phản ứng Mega-PCR lần hai để khuếch đại toàn bộ đoạn gen phyA chứa 4 điểm đột biến. Chu trình nhiệt của phản ứng Mega- PCR đƣợc thiết lập nhƣ sau: 95 ºC: 5 phút; (95 ºC: 30 s, 72 ºC: 3 phút) × 25; 72 ºC: 10 phút, 4 ºC: ∞. Kết quả điện di Hình 3.3-B cho thấy, chúng tơi đã khuếch đại đƣợc đoạn gen phyA kích thƣớc khoảng 1.3 kb tƣơng ứng nhƣ lý thuyết bằng phản ứng PCR với cặp mồi Mega chứa 4 đột biến điểm.