Hiện nay, tế bào nấm men đƣợc coi là giải pháp tốt nhất cho việc biểu hiện protein tái tổ hợp của tế bào nhân thực trên quy mơ sản xuất lớn. Trong đó, Pichia
pastoris là hệ thống biểu hiện đƣợc sử dụng rất phổ biến trong nghiên cứu enzyme
tái tổ hợp hiện nay do chúng có nhiều ƣu điểm nhƣ: là tế bào nhân thực thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và cuộn gập cũng nhƣ các biến đổi sau dịch mã, đây là điều kiện cần thiết để đảm bảo enzyme có hoạt tính; thao tác di truyền thực hiện đơn giản, dễ dàng điều khiển sự biểu hiện, gen ngoại lai đƣợc gài vào genome vật chủ nên biểu hiện có độ ổn định cao; thành phần ni cấy đơn giản, chi phí lên men thấp.
Để biết gen mã hóa phytase từ nấm mốc A. niger sau khi cải biến có cải thiện khả năng hồi tính của enzyme này sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao đồng thời vẫn duy trì đƣợc khả năng bền pH nhƣ gen gốc hay không, chúng tôi cần phải tiến hành chuyển hai gen này vào tế bào nấm men Pichia pastoris X33 để biểu hiện và xác định hoạt tính enzyme phytase tái tổ hợp. Vector biểu hiện pPICZαA/phyA/P12, pPICZαA/phyA/AAS5 đƣợc gài vào hệ gen của Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp biến nạp xung điện, tạo ra thể biến nạp X33.P12 và X33.AAS5 mang gen chỉ thị có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa kháng sinh zeocin, chủng P. pastoris X33 khơng có gen kháng zeocin nên khơng thể phát triển trên môi trƣờng
này. Để kiểm tra gen mã hóa phytase đã đƣợc gài vào genome của các thể biến nạp hay chƣa, chúng tôi sàng lọc bằng cách nuôi biểu hiện trên vi đĩa và phân tích hoạt tính phytase, sau đó tách chiết DNA tổng số của các thể biến nạp sinh phytase cao để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen.
3.2.1. Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp xung điện xung điện
Kỹ thuật biến nạp bằng xung điện đƣợc lựa chọn do ƣu thế về hiệu suất biến nạp cao và hóa chất, thao tác thí nghiệm đơn giản. Dƣới tác dụng của điện trƣờng lớn làm thủng màng tế bào và các phân tử DNA di chuyển theo điện trƣờng vào trong tế bào. Theo lý thuyết, pPICZA mang gen đích sẽ trao đổi chéo và tích hợp vào vùng gen AOX1 của P. pastoris X33 do chúng có chung đoạn gen này. Để tăng
hiệu suất biến nạp, cũng nhƣ tăng hiệu suất trao đổi chéo thì vector biểu hiện pPICZαA/phyA/P12, pPICZαA/phyA/AAS5 đƣợc xử lý bằng enzyme giới hạn MssI ở 37 °C để mở vịng tạo hai phần trình tự promoter AOX1 ở hai đầu và tƣơng đồng với trình tự AOX1 trên hệ gen của Pichia pastoris X33.
Kết quả điện di Hình 3.8 cho thấy, vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 đã đƣợc mở vòng hoàn toàn tạo dạng mạch thẳng có kích thƣớc khoảng 5 kb tƣơng ứng với độ dài 3.6 kb của vector pPICZαA và độ dài đoạn gen phyA khoảng 1,3 kb. Đoạn DNA mạch thẳng này sẽ đƣợc tinh chế bằng bộ kit GenJETTM Gel Extraction để làm nguồn DNA vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen vào tế bào P. pastoris X33.
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1%
trong đệm TAE 0,5×. M: Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1: vector pPICZαA/phyA/P12–MssI; vector pPICZαA/phyA/P12 uncut; vector pPICZαA/phyA/AAS5–MssI, vector pPICZαA/phyA/AAS5 uncut.
Hình 3.9. Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phƣơng pháp xung điện.
Hai gen mã hóa phytase trong vector pPICZαA/phyA/P12, pPICZαA/phyA/AAS5 mở vòng đƣợc đƣa vào tế bào Pichia pastoris X33 theo phƣơng pháp biến nạp xung điện đƣợc trình bày ở mục 2.2.6. Sau 3 ngày nuôi cấy ở 28 °C, trên đĩa thạch YPDS chứa zeocin 100 μg.ml-1
xuất hiện nhiều khuẩn lạc màu trắng sữa. Đĩa đối chứng nuôi cấy chủng Pichia pastoris X33 gốc khơng có khuẩn lạc nào xuất hiện (Hình 3.9). Điều này chứng tỏ, các khuẩn lạc xuất hiện có khả năng đã đƣợc gài gen mã hóa phytase cùng với gen chỉ thị kháng zeocin vào genome P. pastoris X33.
3.2.2. Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris
Để khẳng định vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 đã đƣợc cài vào hệ gen của Pichia pastoris X33, trên mỗi đĩa thạch nuôi cấy chúng tôi lựa
chọn ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc để tách DNA tổng số và PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen T-phyA-EcoRI-F/ phyA-Stop-XbaI-R2. Các khuẩn lạc X33.P12.1, 2, 5, 7; X33.AAS5.1, 2, 3, 6 đƣợc lựa chọn nuôi cấy trên đĩa thạch YPD ở 28 °C trong 2 ngày để thu sinh khối. DNA tổng số đƣợc tách chiết theo quy trình của mục 2.2.7. Sản phẩm DNA thu đƣợc sau đó dùng làm khn để PCR với chu trình nhiệt nhƣ sau: 94 °C: 3 phút, (94 °C: 30 s, 52 °C: 30 s, 70 °C: 1 phút 30 s) ×25, 72°C: 10 phút, 4 °C: ∞. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR cho thấy, 8 thể biến nạp X33.P12.1, 2, 5, 7; X33.AAS5.1, 2, 3, 6 đều xuất hiện băng DNA có kích thƣớc gần với băng DNA thang chuẩn 1,5 kb (Hình 3.10).
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-phyA-EcoRI-F/ phyA-
Stop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE 0,5×. M: Thang chuẩn DNA 1 kb (Thermo scientific); 1-4: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.P12.1, 2,
5, 7; 5-8: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.AAS5.1, 2, 3, 6; 9: sản phẩm PCR với khuôn là DNA của X33.
Kết quả trên đúng nhƣ tính tốn lý thuyết, sản phẩm PCR sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng với gen phyA khoảng 1378 bp. Đối với phản ứng đối chứng âm là sử
dụng DNA tổng số của chủng X33 gốc làm khuôn, chúng tôi không thu đƣợc băng DNA nào. Nhƣ vậy, chúng tơi có thể kết luận là hai gen phyA gốc và phyA cải biến đã đƣợc cài vào genome của Pichia pastoris X33.
3.2.3. Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp
Để kiểm tra khả năng sinh tổng hợp enzyme phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp, chúng tôi chọn ngẫu nhiên 15 khuẩn lạc X33.P12 (có thể mang gen phyA gốc) và 15 khuẩn lạc X33.AAS5 (có thể mang gen phyA cải biến) để tiến hành nuôi cấy biểu hiện trên vi đĩa 24 giếng theo quy trình mục 2.3.8, sau đó xác định hoạt tính phytase theo phƣơng pháp của Shimizu và CS [54]. Chủng P. pastoris X33 gốc không mang gen phyA cũng đƣợc nuôi cấy đồng thời làm đối chứng âm.
Bảng 3.1. Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp biểu hiện trên vi đĩa 24
giếng.
Chủng tái tổ hợp Hoạt tính phytase
(IU ml-1) Chủng tái tổ hợp Hoạt tính phytase
(IU ml-1) X33.AAS5.1 15,25 X33.P12.1 32,83 X33.AAS5.2 44,23 X33.P12.2 25,20 X33.AAS5.3 14,98 X33.P12.3 38,18 X33.AAS5.6 13,35 X33.P12.4 30,80 X33.AAS5.8 18,13 X33.P12.5 33,35 X33.AAS5.9 20,95 X33.P12.6 17,58 X33.AAS5.11 22,75 X33.P12.7 46,93 X33.AAS5.12 28,95 X33.P12.9 14,03 X33.AAS5.13 24,80 X33.P12.10 39,60 X33.AAS5.15 16,65 X33.P12.12 39,53 X33.AAS5.16 17,70 X33.P12.13 34,85 X33.AAS5.17 35,20 X33.P12.14 28,65 X33.AAS5.18 40,95 X33.P12.16 38,13 X33.AAS5.19 38,55 X33.P12.17 41,80 X33.AAS5.20 38,80 X33.P12.20 35,95 X33 0,01
Kết quả phân tích hoạt tính phytase cho thấy, tất cả các thể biến nạp tái tổ hợp đƣợc chọn đều có khả năng sinh tổng hợp enzyme với hoạt tính khá cao từ 13- 47 IU ml-1 (Bảng 3.1). Trong đó, chủng X33.AAS5.2 và X33.P12.7 có khả năng sinh enzyme tốt nhất, lần lƣợt là 44,23 IU ml-1 và 46,93 IU ml-1. Bên cạnh đó, chủng gốc X33 ni cấy biểu hiện khơng có khả năng sinh phytase. Nhƣ vậy, chúng tơi có thể kết luận bƣớc đầu là hai gen phyA gốc và phyA cải biến đã đƣợc chuyển vào tế bào Pichia pastoris X33 thành công.